Latrotoxin

Ett latrotoxin är ett neurotoxin med hög molekylvikt som finns i giftet från spindlar av släktet Latrodectus (änkaspindlar) samt minst en art av ett annat släkte i samma familj, Steatoda nobilis . Latrotoxiner är de huvudsakliga aktiva komponenterna i giftet och är ansvariga för symtomen på latrodektism .

Följande latrotoxiner har beskrivits: fem insekticida toxiner, benämnda α, β, γ, δ och ε-latroinsectotoxiner, ett ryggradsdjursspecifikt neurotoxin , alfa-latrotoxin och ett toxin som påverkar kräftdjur , α-latrocrustatoxin.

a-Latrotoxin

Det bäst studerade latrotoxinet är alfa-latrotoxin, som verkar presynaptiskt för att frigöra signalsubstanser (inklusive acetylkolin ) från sensoriska och motoriska neuroner, såväl som på endokrina celler (för att till exempel frigöra insulin ). Det är ett ~130 kDa protein som huvudsakligen existerar i sina dimeriserade eller tetrameriserade former.

α-Latrotoxin ( α-LTX ) kan naturligt hittas i änkspindlar av släktet Latrodectus . Den mest kända av dessa spindlar är de svarta änkorna, Latrodectus mactans . Giftet från änkespindlar ( Latrodectus ) innehåller flera proteingifter, kallade latrotoxiner, som selektivt riktar sig mot antingen ryggradsdjur , insekter eller kräftdjur . Ett av dessa toxiner är α-latrotoxin och riktar sig selektivt mot ryggradsdjur; det är ineffektivt för insekter och kräftdjur. α-LTX har en hög affinitet för receptorer som är specifika för neuronala och endokrina celler hos ryggradsdjur.

Biosyntes

När DNA-sekvensen för α-LTX transkriberas och translateras, bildas en inaktiv prekursormolekyl av α-LTX (156,9 kDa). Denna prekursormolekyl genomgår posttranslationell bearbetning där det slutliga, aktiva a-LTX-proteinet (131,5 kDa) bildas.

N-terminalen av a-LTX-prekursormolekylen föregås av korta hydrofila sekvenser som slutar med ett kluster av basiska aminosyror. Dessa kluster känns igen av proteolytiska enzymer (furinliknande proteaser ), som klyver och aktiverar α-LTX-prekursormolekylerna med hjälp av hydrolys. Även C-terminalen känns igen av dessa furinliknande proteaser och klyvs också.

α-LTX-prekursormolekyler syntetiseras av fria ribosomer i cytosolen och är därför cytosoliska i giftkörtlarnas sekretoriska epitelceller . De kan dock associeras med sekretoriska granuler även om de inte tas upp i granulernas lumen. Den cytosoliska α-LTX-prekursormolekylen frigörs från cellen med hjälp av holokrin sekretion där den hamnar i spindelns giftkörtel. Denna körtel innehåller flera proteaser som är involverade i klyvningen av prekursorn a-LTX-molekylen.

α-LTX-proteinets tertiära struktur kan delas upp i tre delar: den N-terminala vingen (36 kDa), kroppen (76 kDa) och det C-terminala huvudet (18,5 kDa). På grund av C-terminala ankyrinupprepningar, som förmedlar protein-proteininteraktioner, bildar α-LTX-monomeren en dimer med en annan α-LTX-monomer under normala förhållanden. Tetramerbildning aktiverar toxicitet.

Toxikokinetik

α-LTX påverkar motoriska nervändar och endokrina celler. Inga större enzymatiska aktiviteter är associerade. Istället kan toxinet bilda porer i lipidmembranen och inducera Ca ²⁺ jonflöde. Debuten av effekter av berusning kan inträffa med en fördröjningsperiod på 1 till 10 minuter, även vid subnanomolära koncentrationsnivåer. Vid nanomolära koncentrationer uppstår utbrott av neurotransmittorfrisättning. Efter skurarna träder långa perioder av steady-state release i kraft.

Stimulering av små verkanspotentialer på ändplattan induceras initialt av neurotoxinet, medan senare neurotransmissionen blockeras vid den neuromuskulära förbindelsen. Detta beror på utarmning av synaptisk vesikelinnehåll.

Toxikodynamik

α-LTX i sin tetramera form interagerar med receptorer ( neurexiner och latrofiliner ) på det neuronala membranet, vilket orsakar införande av α-LTX i membranet.

När tetrameren väl sätts in i cellmembranet kan två verkningsmekanismer inträffa. För det första kan insättning leda till porbildning och eventuellt andra effekter, och för det andra kan receptorn aktiveras, vilket leder till intracellulär signalering. De fyra huvudena på tetrameren bildar en skål som omger poren, som vid en punkt är begränsad till 10 Å. Millimolära koncentrationer av Ca ²⁺ och Mg ²⁺ katalyserar kraftigt tetramerbildning, vilket tyder på att det tetrametriska tillståndet är divalent katjonberoende, medan EDTA gynnar bildningen av dimeren. Forskning visar också att koncentrationer av La ³⁺ högre än 100 μM blockerar också tetramerisering. Porbildning kan förekomma i rena lipidmembran, men rekonstituerade receptorer ökar porbildningen kraftigt. Biologiska membran blockerar porbildning när inga α-LTX-receptorer finns (neurexin, latrofilin, PTPσ). Det är också känt att de tre höggradigt konserverade cysteinresterna är involverade i a-LTX-receptorbindning, eftersom mutanter innehållande serin istället för cysteinrester inte inducerade toxicitet. Den N-terminala domänen måste vikas ordentligt, där disulfidbindningarna måste vara funktionella. α-LTX-toxinet är bundet av ett litet protein, LMWP eller latrodektin. Det har observerats att porbildning i lipiddubbelskikt är omöjlig när latrodektin inte är tillgängligt. Laktrodektin har ingen effekt på α-LTX-toxicitet.

Porbildning

Porerna som bildas av α-LTX i membranet är permeabla för Ca ²⁺ och tillåter därför ett inflöde av Ca ²⁺ in i cellen. Detta inflöde till en exciterbar cell stimulerar exocytos direkt och effektivt. Katjoninflödet är proportionellt mot mängden porer och därmed mängden involverade receptorer som uttrycks på cellmembranet. Även Ca ²⁺ underlättar starkt bildningen av tetramererna och därmed dess porbildning. Poren är också genomsläpplig för signalsubstanser, vilket orsakar massivt läckage av signalsubstanspoolen i cytosolen .

Vid sidan av inflödet av Ca2 ⁺ är kanalen inte särskilt selektiv, vilket tillåter Na ⁺ , K ⁺ , Ba2 ⁺ , Sr2 ⁺ , Mg2 ⁺ , Li ⁺ och Cs ⁺ att också passera membranet. Poren är öppen för det mesta, med en öppen sannolikhet på 0,8. De flesta trivalenta katjoner blockerar kanaler vid 50-100 μM, såsom Yb ³⁺ , Gd ³⁺ , Y ³⁺ , La ³⁺ och Al ³⁺ .

Poren är inte bara genomsläpplig för katjoner, utan även för vatten. Detta orsakar svullnad i nervterminalen. Ytterligare membranpotentialstörningar uppstår på grund av permeabiliteten hos små molekyler, såsom neurotransmittorer och ATP för att passera genom α-LTX-poren.

Membranpenetration

Även om tetramerisk porbildning av α-latrotoxin har visats definitivt ^{[ citat behövs ]} tvistar vissa författare fortfarande om detta är det huvudsakliga verkningssättet för α-latrotoxin och tror att α-latrotoxin (tetrameriskt eller inte) kan penetrera genom membranet av målceller för att interagera direkt med intracellulära neurotransmittorfrisättningsmaskineri. ^{[ citat behövs ]}

Receptorer

Följande mekanism föreslås för receptorförmedlade effekter. Tre receptorer för α-latrotoxin har beskrivits:

neurexin
latrofilin (alias CIRL, kalciumoberoende receptor för latrofilin)
proteintyrosinfosfatas sigma (PTPσ).

Toxinet stimulerar en receptor, troligen latrofilin, som är en G-proteinkopplad receptor kopplad till Gαq/11. Nedströmseffektorn av Gαq/11 är fosfolipas C (PLC). När PLC aktiveras ökar cytosolkoncentrationen av IP3, vilket i sin tur inducerar frisättning av Ca ²⁺ från intracellulära förråd. Denna ökning av cytosoliskt Ca ²⁺ kan öka sannolikheten för frisättning och hastigheten för spontan exocytos. Latrofilin med α-LTX kan inducera aktiveringen av proteinkinas C (PKC). PKC är ansvarig för fosforyleringen av SNARE-proteiner. Således inducerar latrofilin med α-LTX effekten av exocytos av transportvesiklar. Den exakta mekanismen måste upptäckas.

Signal

Förutom de huvudsakliga effekterna av porbildning av α-latrotoxin, medieras andra effekter av α-latrotoxin genom interaktion med latrofilin och intracellulär signalering (se signaltransduktion ). ^{[ citat behövs ]}

Strukturaktivitetsrelation (SAR)

Den naturligt förekommande α-LTX-dimeren måste bilda en tetramer för att vara giftig. Tetramerisering sker endast i närvaro av bivalenta katjoner (som Ca ²⁺ eller Mg ²⁺ ) eller amfipatiska molekyler. De fyra monomererna som bildar denna tetramer är symmetriskt arrangerade runt en central axel, som liknar en fyrbladig propeller med en diameter på 250 Å och en tjocklek på 100 Å. Huvuddomänerna bildar den kompakta, centrala massan sammanförd och omgiven av kroppsdomänerna. Vingarna står vinkelrätt mot tetramerens axel. På grund av denna form innehåller tetrameren en päronformad kanal i den centrala massan. I den nedre änden är diametern på denna kanal 25 Å, sedan vidgar den till 36 Å för att begränsas till 10 Å i toppen.

Basen på tetrameren (under vingarna) är 45 Å djup och är hydrofob, vilket förmedlar införande i cellmembranet. Också införande av tetrameren är endast möjlig i närvaro av vissa receptorer (främst neurexin Iα och latrofilin och PTPσ i mindre utsträckning) på membranet. Neurexin Iα förmedlar endast insättning under närvaro av Ca ²⁺ , medan latrofilin och PTPσ kan mediera insättning utan närvaro av Ca ²⁺ . Så på grund av kanalen och införandet i cellmembranet gör proteinet cellen mer permeabel för ämnen som kan passera genom kanalen. Dessa ämnen är mono- och bivalenta katjoner, signalsubstanser, fluorescerande färgämnen och ATP.

Giftighet

LD50 för α-LTX hos möss är 20–40 μg/kg kroppsvikt.

LD50 för Latrodectus -gift i mg/kg för olika arter: groda = 145, koltrast = 5,9, kanariefågel = 4,7, kackerlacka = 2,7, kyckling = 2,1, mus = 0,9, husfluga = 0,6, duva = 0,4, marsvin = 01. .

Vetenskapligt bidrag

αLTX har hjälpt till att bekräfta den vesikulära transporthypotesen om transmittorfrisättning, fastställa kravet på Ca ²⁺ för vesikulär exocytos och karakterisera individuella transmittorfrisättningsställen i det centrala nervsystemet. Det hjälpte till att identifiera två familjer av viktiga neuronala cellytereceptorer.

Den muterade formen av αLTX, som kallas αLTXN4C och inte bildar porer, har bidragit till forskningen. Det hjälpte tillvägagångssättet för att dechiffrera den intracellulära signaltransduktionsmekanismen stimulerad av αLTX. Det mutanta toxinet kan också användas för att studera karaktären och egenskaperna hos intracellulära Ca ²⁺ -förråd som är inblandade i toxinreceptortransduktionsvägen och deras effekt på framkallade postsynaptiska potentialer. Det mutanta toxinet kan också vara ett instrument för att belysa de endogena funktionerna hos αLTX.

Andra giftkomponenter

Änkespindlarnas naturliga byte är insekter, och flera insektotoxiner finns i dess gift. Latroinsectotoxinerna verkar ha liknande strukturer.

Högmolekylära proteiner som har isolerats från Medelhavets svarta änka ( L. tredecimguttatus ) inkluderar de insektsspecifika neurotoxinerna α-latroinsectotoxin och δ-latroinsectotoxin, ett neurotoxin som påverkar kräftdjur känt som latrocrustatoxin som hämmar angiotensin och små peptider . -omvandlande enzym .

Bortsett från de högmolekylära latrotoxiner som beskrivits ovan, innehåller Latrodectus venom också lågmolekylära proteiner vars funktion inte har utforskats fullt ut ännu, men kan vara involverade i att underlätta membraninsättning av latrotoxiner.