Kalciseptin

Calciseptine
En modell av 3D-strukturen av calciseptine, baserad på en NMR-struktur av dess homolog FS2 (​). Disulfidbroar visas i gult. De tre resterna som skiljer sig mellan FS2 och kalciseptin visas i rött.
Identifierare
Organism	Dendroaspis polylepis polylepis
Symbol	CaS
UniProt	P22947
Söka efter Strukturer Schweizisk modell Domäner InterPro

Calciseptine ( CaS ) är ett naturligt neurotoxin isolerat från den svarta mamban Dendroaspis p. polylepis gift . Detta toxin består av 60 aminosyror med fyra disulfidbindningar . Calciseptine blockerar specifikt L-typ kalciumkanaler , men inte andra spänningsberoende Ca ²⁺ kanaler såsom N-typ och T-typ kanaler.

Historia

Den svarta mamban ( Dendroaspis polylepis ) anses allmänt vara en av de dödligaste ormarna på planeten och är ansvarig för många dödsfall i hela dess område söder om Sahara . Utan behandling orsakar bettet av en Black Mamba 100 % dödlighet.

Giftet från Black Mamba består av mer än 28 peptider. En av dessa peptider är kalciseptin. Den utgör 2,8% av giftet från Black Mamba . När den först renades, kallades peptiden protein E3, som senare ändrades till kalciseptin av Weille et al.

Betydelse

Calciseptine har visat sig specifikt hämma de spänningsstyrda Ca ²⁺ -kanalerna av L-typ och var den första naturliga polypeptiden som upptäcktes med denna egenskap. Specifika polypeptidhämmare av spänningskänsliga kanaler är viktiga verktyg i forskningen och var redan kända för spänningskänsliga Na ⁺ -kanaler, både spänningskänsliga och Ca ²⁺ -aktiverade K ⁺ -kanaler, och för N-typ Ca ²⁺ -kanaler .

Innan kalciseptin sekvenserades och visades vara en specifik kalciumkanalhämmare av L-typ var inga specifika polypeptidinhibitorer kända för denna typ av spänningsstyrda kanaler. Specifika blockerare av kanalen av L-typ var små organiska molekyler som 1,4- dihydropyridiner . Det föreslogs att polypeptidhämmare kunde hittas i ormgift. Calciseptine bekräftade detta eftersom det visade sig inte bara blockera kanalerna av L-typ specifikt, utan också göra detta på exakt samma plats som 1,4- dihydropyridinerna . Efter kalciseptin hittades också andra polypeptider som specifikt blockerar L-typkanalerna: FS2, C10S2C2 och S4C8.

Isolering/syntes

Kalciseptin finns bara i Black Mamba och kan renas från det råa giftet. Ormen kan mjölkas för att förvärva giftet. Schweitz et al. använde en trestegsmetod för att rena kalciseptin till homologi. De tre stegen var: 1) gelfiltrering, 2) jonbyte på TSK SP 5PW och 3) omvänd faskromatografi på RP18.

Forskare lyckades också syntetisera kalciseptin i labbet. FS2, som är en annan komponent i Black Mambas gift och är homolog med calciseptine, kan också syntetiseras i labbet.

Strukturera

Trefingrad toxinfamilj

Huvudartikel: Tre-finger toxin

Calciseptine är en medlem av en familj av giftiga peptider som finns i ormgift. Proteiner från denna familj är små och består av 58 till 74 aminosyror. De har alla samma trefingrade struktur som uppstår genom bildandet av fyra disulfidbryggor mellan åtta cysteinrester.

Aktiviteterna för dessa toxiner - även om de är medlemmar av samma familj - är faktiskt ganska olika och kan variera från blockering av acetylkolinreceptorer till förändring av membranpermeabiliteten. Deras gemensamma drag är att de alla påverkar signalöverföringen på något sätt.

Ordningsföljd och struktur

Kalciseptin i sig består av 60 aminosyror och har sekvenserats fullt ut:

RICYIHKASL PRATKTCVEN TCYKMFIRTQ REYISERGCG CPTAMWPYQT ECCKGDRCNK

Den tredimensionella strukturen av kalciseptin har inte bestämts experimentellt. Ett annat toxin som finns i svart mambagift, kallat FS2, skiljer sig sekventiellt från kalciseptin i endast tre rester: det innehåller ett serin istället för isoleucin i position 5, en histidin istället för glutamin i position 30 och en glutamin istället för glutaminsyra i position 5. position 32. En tredimensionell struktur av FS2 har bestämts med användning av NMR , och på grund av de mindre sekventiella skillnaderna kan detta tjäna som en modell av kalciseptinstrukturen.

Toxikokinetik

Absorption och distribution

Eftersom kalciseptin injiceras av ormen i sitt byte tillsammans med resten av dess gift, behöver det inte passera hudens skyddande barriär och injiceras direkt i bytesvävnaden och/eller blodomloppet. Ingen forskning har utförts på toxicokinetics av ​​calciseptine specifikt, men allmän forskning om orm toxin dynamik är tillgänglig. Även om de toxiska peptiderna i allmänhet är små (cirka 60 aminosyror), är deras storlek tillräcklig för att hindra dem från att korsa epitelskikt som blod- hjärnbarriären .

Biotillgänglighetsmätningar har utförts för flera ormgift. Till exempel kobragift visat sig ha en biotillgänglighet på 41,7 % när det injiceras intramuskulärt, och för andra gifter kan detta till och med vara mindre än 10 %. Dessa värden är ganska låga jämfört med de för de flesta terapeutiska läkemedel, som vanligtvis har en biotillgänglighet på nästan 100 % efter intramuskulär injektion. I allmänhet har toxiska peptider med 10-40 aminosyror visat sig ha en relativt dålig biotillgänglighet på grund av deras storlek och hydrofilicitet. Således förväntas kalciseptin, innehållande 60 aminosyror, också ha låg biotillgänglighet.

Ämnesomsättning

Eftersom kalciseptin är en peptid kan det teoretiskt brytas ned av proteaser i vävnaderna där det injiceras. Det har visat sig att nedbrytning av ormtoxiska peptider av proteaser förekommer i bytesvävnaderna, men på grund av toxinernas relativa stabilitet, hastigheten med vilken toxinerna verkar och mängden gift som injiceras är detta inte tillräckligt för att skydda mot konsekvenserna av ett ormbett. Samma sak gäller för immunsystemet: de större giftpeptiderna kommer sannolikt inte att missas av immunsystemet, men immunologisk verkan är inte tillräckligt snabb för att motverka effekterna av giftet.

Som nämnts ovan har kalciseptin en trefingrad struktur som vanligtvis finns i toxiner. Även om många toxiner har denna struktur, är deras funktioner olika. Anledningen till att denna struktur är så mycket bevarad är förmodligen dess stabilitet: cysteinbryggorna skapar en stabil kärna, som möjligen bromsar nedbrytningen av proteinet av proteaser.

Handlingsmekanism

Calciseptin har visat sig blockera kalciumkanaler av L-typ, vilket hämmar den glatta muskelkontraktionen och hjärtfunktionen.

Spänningsaktiverade kalciumkanaler

Spänningsberoende kalciumkanaler är viktiga för att generera elektriska signaler i exciterbara celler som neuroner och hjärt- eller glatta muskelceller . N-typ Ca ²⁺ kanaler finns i neuronala celler och spelar en viktig roll i kopplingen av nervexcitation och neurotransmittorutsöndring . L-typ kalciumkanaler finns i hjärt- och glatta muskelceller, vilket kopplar excitation till muskelkontraktion. Andra typer av spänningsaktiverade Ca2 ⁺ -kanaler inkluderar kanaler av T-typ och P-typ.

Blockering av L-typ kalciumkanaler

Eftersom närvaron av kalcium i cytosolen krävs för muskelkontraktion, hindrar blockerare av kalciumkanaler musklerna från att bygga upp spänningar. Blockerare av kalciumkanalerna av L-typ , som förekommer i hjärtat och glatt muskulatur , fungerar således som glattmuskelavslappnande medel och hämmare av hjärtkontraktioner. Vanliga blockerare av kalciumkanaler av L-typ är 1,4- dihydropyridiner , som används vid behandling av hjärt-kärlsjukdomar. På grund av sin aktivitet som avslappnande medel kan de slappna av de glatta musklerna som omger blodkärlen, vilket vidgar dem och sänker blodtrycket.

Calciseptine som en kalciumkanalblockerare av L-typ

Calciseptin liknar de ovan nämnda 1,4- dihydropyridinerna i sin biologiska verkan, eftersom det har samma förmåga att binda och blockera kalciumkanalerna av L-typ i glatt- och hjärtmuskel.

Aminosyrorna som är ansvariga för att binda och blockera kalciumkanalerna av L-typ är sannolikt belägna i det tredje "fingret" av kalciseptinstrukturen, någonstans mellan aminosyrorna 40 och 50. Även om peptider från den trefingrade familjen har likadana strukturer, är det bara några av dem kan binda och blockera kalciumkanaler. Flera sekvensinriktningsstudier gav 12 aminosyrarester som var unika för toxiner med kanalblockerande aktiviteter. Dessa rester är belägna vid spetsarna av slingorna II och III i den trefingrade strukturen. En modell har föreslagits där aminosyrorna 45 till 48, MWPY, av FS2-toxinet anses binda kalciumkanalerna. Denna modell är baserad på en förutsägelse av interaktionerna mellan dessa aminosyror och kalciumkanalen. Dessa interaktioner liknar de hydrofoba och vätebindande egenskaperna hos nifedipin , en känd 1,4-dihydropyridinblockerare. På grund av likheterna mellan kalciseptin och FS2, kan denna modell redogöra för interaktionerna mellan kalciseptin och kalciumkanalerna av L-typ.

En annan modell är baserad på ett större segment av samma loop, innehållande aminosyrorna 42 till 47, PTAMWP. Eftersom platser för protein-proteininteraktion ofta har visat sig flankeras av proliner, indikerar närvaron av de två prolinerna i detta "finger" av strukturen ett möjligt interaktionsställe. En kort polypeptid med åtta aminosyrarester, innehållande denna sekvens, visade sig verkligen blockera kalciumkanalerna av L-typ, dock med en lägre aktivitet.

Dessa interagerande aminosyror finns också i två andra L-typ kalciumkanalblockerande proteiner, C10S2C2 och S4C8. Även om båda dessa toxiner är medlemmar av den trefingrade familjen, är den trefingrade strukturen förmodligen inte ett krav för kanalblockering: andra ormtoxiner, inklusive dendrotoxin , har liknande effekter på olika kanaler, men visar inte de trefingrade. strukturera.

Indikationer/Symtom

Typiska symtom efter att ha blivit biten av en Black Mamba inkluderar den snabba uppkomsten av yrsel, dåsighet och hosta och andningssvårigheter. Andra troliga symtom inkluderar kramper, neuromuskulära symtom, chock, medvetslöshet, hypotoni , ataxi , överdriven salivutsöndring , förlamning av armar och ben, illamående och kräkningar, feber och svår buksmärta. Permanent lemförlamning är mycket sannolikt om bettet förblir obehandlat. I det allvarligaste fallet, om det inte behandlas, kan bettet från Black Mamba leda till döden genom kvävning, till följd av förlamning av andningsmusklerna.

Alla dessa symtom beror på en kombination av alla giftiga peptider som det råa giftet från Black Mamba innehåller. Symtomen är relaterade till kalciseptin eftersom det också fungerar som ett glattmuskelavslappnande medel, vilket förklarar den tidiga uppkomsten av andningssvårigheter, lemförlamning och till och med död genom kvävning. Calciseptin är känt för att ha en hypotensiv effekt. Det kan inte klart fastställas vilken peptid som är mest ansvarig för vilket symptom, eftersom kombinationer av olika toxiner kan ha olika effekter.

Motgift

Vid bett från den svarta mamban ska offret behandlas enligt ett standardprotokoll. Den viktigaste delen av denna behandling är den intravenösa injektionen av ett polyvalent antigift . Sydafrikanska vaccinproducenter producerar detta antigift. Polyvalent betyder att den kan användas för olika ormbett: huggormar , mambas och kobror . Stora mängder av antigiftet måste injiceras för att motverka effekterna av giftet.

Det flervärda antiveninet framställs genom att hästar injiceras med anpassat gift. Giftet avgiftas först för att förhindra för mycket skada och dödsfall. Detta görs mestadels genom att komplexbinda giftet med en aldehyd som formalin. Giftet administreras också med ett adjuvans , som aluminiumhydroxid eller natriumalginat, för att stimulera det immunologiska svaret. När giftet injiceras kommer kroppen att producera antikroppar . Dessa kommer att binda komponenter – variationen av peptider – i giftet, som förhindrar ytterligare aktivitet hos molekylen och i slutändan avlägsnas av kroppens immunsystem. Dessa antikroppar samlas upp och renas från blodet och förpackas sedan i huvudsakligen flytande form. Hästar används på grund av den stora blodvolymen. Den slutliga antigiftprodukten går ut efter 5 år och måste helst förvaras svalt, 4-8 °C. Den kan dock överleva olika miljösituationer under några veckor till månader utan att förlora sin styrka.

Eftersom flera gift från olika ormar injiceras med tiden kommer hästen att utveckla olika antikroppar mot alla gifterna. Detta ger antiveninet dess polyvalenta egenskap. Detta ökar också styrkan hos antiveninet. Vissa gifter kan inte inducera immunsystemet tillräckligt på egen hand eller kombinationen av två eller flera gifter resulterar i ett bättre svarande antivenin.

Giftighet

Dödlighet

Kalciseptin är giftigt i låga doser. Inga specifika data finns tillgängliga om toxiciteten av kalciseptin hos människor. Men LD ₅₀ -värdena för möss har bestämts och kan hittas i tabellen nedan:

Administrationssätt	LD 50 värde
Intravenös injektion	0,25 mg/kg
Subkutan injektion	0,38 mg/kg
Intraperitoneal injektion	0,94 mg/kg

Gifttoxicitet

Black Mamba kan injicera mellan 100–120 mg gift i en tugga. Att jämföra LD ₅₀ -resultaten med mängden gift som kan injiceras visar att ett bett är dödligt. För människor räcker en dos på 10–15 mg för att vara dödlig.

Övriga uppgifter

Kalciseptin har en effekt på de K ⁺ -inducerade kontraktionerna och L-typ Ca2 ⁺ -kanalaktivitet, IC50- _värdena bestämdes och gav värden på 230 respektive 430 nM. Kalciseptin har också en effekt på hjärtfunktionen. ICso- _värdet som hittades för denna vävnad var 15 nM. Dessa värden bestämdes på råttor och möss.

Synergistisk toxicitet

Det har visat sig att vissa trefingrade toxiner från mambagift interagerar synergistiskt med varandra. De molekylära mekanismerna för dessa interaktioner är fortfarande okända. Det är inte heller känt om kalciseptin har en synergistisk effekt med andra giftföreningar.

Effekter på djur

Kalciseptin har undersökts in vivo och in vitro hos alla typer av djur, men mest på råttor. Calciseptine slappnar av förkontrakterad råtta (bröst)aorta och sänker blodtrycket drastiskt.

Minskningen av blodtrycket visar en kombination av kort- och långvariga effekter. Den tidiga, akuta starten tog fem minuter, och effekten kunde vara i 120 minuter eller längre. Dessutom hade kalciseptin endast en liten effekt på hjärtrytmen och ändrade den endast något. Dessutom kan den också slappna av luftstrupens ringar i lungorna. Dessa effekter kan förklaras av den avslappnande aktiviteten hos kalciseptin på olika glatta muskelceller . Den hämmande effekten av kalciseptin resulterar i ett minskat eller totalt försvinnande av elektrisk aktivitet i dessa celler. Den totala hämmande effekten beror på vävnaden: det kardiovaskulära systemet är det mest sårbara, medan neuronala celler är mindre sårbara och skelettmuskelceller är helt resistenta. Denna skillnad i vävnadskänslighet orsakas troligen av små skillnader i kalciumkanalerna av L-typ i dessa vävnader. Dessa effekter kan uppstå vid låga utsatta mängder på 0,1 till 1 μM kalciseptin. I musmyotub visar Ca ²⁺ strömmarna högre amplitud efter inkubation i kalciseptin (1 μM). Denna effekt av kalciseptin på Ca ²⁺ strömmen utvecklas relativt snabbt. Kalciseptin ändrar reverseringspotentialen för Ca ²⁺ strömmen i musmyotuber. Hos vuxna grodas skelettmuskelfibrer orsakar kalciseptin också en ökad Ca ²⁺ ström. Denna ökning är jämförbar med ökningen som hittades i musmyotuber. I motsats till musmyotuberna ändrade inte kalciseptin reverseringspotentialen för Ca ²⁺ -strömmen. I råttmuskelfibrer efter applicering av kalciseptin fanns mycket små förändringar i ryckspänningar, vilket visar oss att peptiden hade mycket liten effekt på muskelkontraktion. Kalciseptin hade också liten effekt på grodmuskelfibrer.

Det finns en liten effekt av kalciseptin under en serie repetitiva stimuli som genererar stelkramp ; kalciseptin ökade tetanisk spänning. Den genomsnittliga tetaniska spänningen efter applicering av kalciseptin var något högre än kontrollvärdet. Även om kalciseptin ger en ökad laddningsrörelse och ökat inflöde av Ca ²⁺ genom kanaler av L-typ har detta inga större effekter på muskelkontraktionen, inte ens vid stelkramp.

Forskning på råttor och marsvin visade att syntetiskt kalciseptin och FS2 också har samma effekt som deras naturliga motsvarigheter.