Phalloidin
|
|
|
|
| Identifierare | |
|---|---|
|
3D-modell ( JSmol )
|
|
| ChEBI | |
| ChemSpider | |
| ECHA InfoCard | 100.037.697 |
|
PubChem CID
|
|
| UNII | |
|
CompTox Dashboard ( EPA )
|
|
|
|
|
|
| Egenskaper | |
| C35H48N8O11S _ _ _ _ _ _ _ _ | |
| Molar massa | 788,87 g-mol -1 |
| Utseende | Nålar |
| Smältpunkt | 281 °C (538 °F; 554 K) (hydrerad) |
|
Om inte annat anges ges data för material i standardtillstånd (vid 25 °C [77 °F], 100 kPa).
|
|
Falloidin tillhör en klass av toxiner som kallas fallotoxiner , som finns i dödslocksvampen ( Amanita phalloides ) . Det är en stel bicyklisk heptapeptid som är dödlig efter några dagar när den injiceras i blodomloppet. Det huvudsakliga symtomet på falloidinförgiftning är akut hunger på grund av förstörelsen av leverceller. Det fungerar genom att binda och stabilisera filamentöst aktin (F-aktin) och förhindrar effektivt depolymerisering av aktinfibrer. På grund av dess täta och selektiva bindning till F-aktin, används derivat av falloidin innehållande fluorescerande taggar i stor utsträckning i mikroskopi för att visualisera F-aktin i biomedicinsk forskning.
Upptäckt och bakgrund
Phalloidin var en av de första cykliska peptiderna som upptäcktes. Den isolerades från death cap-svampen och kristalliserades av Feodor Lynen och Ulrich Wieland 1937. Dess struktur är ovanlig eftersom den innehåller en cystein - tryptofan- koppling för att bilda en bicyklisk heptapeptid. Denna koppling hade inte karakteriserats tidigare och gör strukturbelysningen av falloidin betydligt svårare. De bestämde närvaron av svavelatomen med hjälp av UV-spektroskopi och fann att denna ringstruktur hade en något förskjuten våglängd. Raney nickelexperiment bekräftade närvaron av svavel i tryptofanringen. Forskarna fann att det avsvavlade falloidinet fortfarande var cirkulärt, vilket visade att strukturen av falloidin normalt är bicyklisk. När den väl var linjär klargjordes aminosyrasekvensen av avsvavlat falloidin genom Edman-nedbrytning av Wieland och Schön 1955.
På grund av dess höga affinitet för aktin, upptäckte forskare dess potentiella användning som ett färgningsreagens för effektiv visualisering av aktin i mikroskop. Derivat konjugerade med fluoroforer säljs i stor utsträckning. På grund av dess förmåga att selektivt binda filamentöst aktin (F-aktin) och inte aktinmonomerer (G-aktin), är fluorescensmärkt falloidin effektivare än antikroppar mot aktin.
Syntes
Biosyntes
Phalloidin är en bicyklisk heptapeptid som innehåller en ovanlig cystein-tryptofanbindning. Genen som kodar för syntes av falloidin är en del av MSDIN-familjen i Death Cap-svampen och kodar för en propeptid på 34 aminosyror. En prolinrest flankerar regionen med sju rester som senare kommer att bli falloidin. Efter translation måste peptiden proteolytiskt excideras, cykliseras, hydroxyleras, Trp-Cys tvärbindas för att bilda tryptationin och epimeriseras för att bilda en D-Thr. Ordningen och den exakta biokemiska mekanismen för dessa steg är ännu inte helt klarlagda. Den nuvarande uppfattningen är att de nödvändiga biosyntetiska generna är samlade nära MSDIN-generna.
Den första post-translationella modifieringen av 34-meren är proteolytisk klyvning via ett prolyloligopeptidas (POP) för att avlägsna den 10-aminosyror långa "ledande" peptiden. POP cykliserar sedan heptapeptiden Ala-Trp-Leu-Ala-Thr-Cys-Pro genom transpeptidering mellan aminosyra 1 (Ala) och aminosyra 7 (Pro). Man tror att bildningen av tryptationin genom Trp-Cys tvärbindning sker därefter.
Kemisk syntes
Eftersom falloidin utnyttjas för sin förmåga att binda och stabilisera aktinpolymerer men celler inte lätt kan ta upp det, har forskare funnit att falloidinderivat är mer användbara i forskning. I huvudsak följer den typisk syntes av små peptider, med användning av hydroxyl-prolin. Den största svårigheten vid syntes är bildningen av tryptationinbindningen (cystein - tryptofan tvärbindning).
Nedan är den allmänna syntetiska mekanismen utförd av Anderson et al. år 2005 för fastfassyntesen av ala 7 -falloidin, som skiljer sig vid rest 7 från falloidin som anges nedan. THPP står för tetrahydropyranylpolystyrenlinker, som används för att förbinda molekylen med det fasta underlaget under syntes. Observera att syntesen nedan helt enkelt är ett allmänt schema för att visa ordningen för bindningsbildning för att koppla samman utgångsmaterialen. Ala7 -falloidin såväl som många andra liknande varianter av falloidin är användbara för att öka cellupptaget i förhållande till falloidin och för att fästa en fluorofor för att underlätta visualiseringen av F-aktin i mikroskopi .
Den första totala syntesen av falloidin uppnåddes genom en kombination av fastfas- och lösningsfassyntes (Baosheng Liu och Jianheng Zhang, USA-patent, US 8 569 452 B2). De fysiska och kemiska egenskaperna hos det syntetiska falloidinet är desamma som det naturligt förekommande falloidinet.
Handlingsmekanism
Falloidin binder F- aktin , förhindrar dess depolymerisering och förgiftar cellen. Falloidin binder specifikt vid gränssnittet mellan F-aktin-subenheter och låser samman intilliggande subenheter. Phalloidin, en bicyklisk heptapeptid, binder till aktinfilament mycket hårdare än till aktinmonomerer, vilket leder till en minskning av hastighetskonstanten för dissociering av aktinsubenheter från filamentändar, vilket i huvudsak stabiliserar aktinfilament genom att förhindra filamentdepolymerisation. Dessutom har falloidin visat sig hämma ATP-hydrolysaktiviteten av F-aktin. Således fångar falloidin aktinmonomerer i en konformation som skiljer sig från G-aktin och det stabiliserar strukturen av F-aktin genom att kraftigt reducera hastighetskonstanten för monomerdissociation, en händelse associerad med infångningen av ADP. Sammantaget har falloidin visat sig reagera stökiometriskt med aktin, starkt främja aktinpolymerisation och stabilisera aktinpolymerer.
Falloidin fungerar olika vid olika koncentrationer i celler. När det införs i cytoplasman i låga koncentrationer, rekryterar falloidin de mindre polymeriserade formerna av cytoplasmatiskt aktin såväl som filamin till stabila "öar" av aggregerade aktinpolymerer, men det stör inte stressfibrer, dvs tjocka buntar av mikrofilament. Wehland et al. noterar också att vid högre koncentrationer inducerar falloidin cellulär kontraktion.
Symtom
Strax efter upptäckten injicerade forskare falloidin i möss och upptäckte att dess LD 50 är 2 mg/kg via IP-injektion . När de exponerades för den minsta dödliga dosen tog det flera dagar för dessa möss att dö. Den enda uppenbara biverkningen av falloidinförgiftning är extrem hunger. Detta beror på att falloidin endast tas upp av levern via gallsaltmembrantransportproteiner. Väl inne i levern binder falloidin F-aktin, vilket förhindrar dess depolymerisering. Det tar tid för denna process att förstöra levercellerna. Njurarna kan också ta upp falloidin, men inte lika effektivt som levern. Här orsakar falloidin nefros.
Använd som ett bildverktyg
Phalloidins egenskaper gör det till ett användbart verktyg för att undersöka fördelningen av F-aktin i celler genom att märka falloidin med fluorescerande analoger och använda dem för att färga aktinfilament för ljusmikroskopi. Fluorescerande derivat av falloidin har visat sig vara enormt användbara för att lokalisera aktinfilament i levande eller fixerade celler såväl som för att visualisera individuella aktinfilament in vitro . En högupplöst teknik utvecklades för att detektera F-aktin vid ljus- och elektronmikroskopiska nivåer genom att använda falloidin konjugerat till fluoroforen eosin som fungerar som den fluorescerande taggen. I denna metod känd som fluorescensfotooxidation kan fluorescerande molekyler användas för att driva oxidationen av diaminobensidin (DAB) för att skapa en reaktionsprodukt som kan göras elektrontät och detekterbar med elektronmikroskopi. Mängden visualiserad fluorescens kan användas som ett kvantitativt mått på mängden filamentöst aktin som finns i celler om mättande kvantiteter av fluorescerande falloidin används. Följaktligen kan immunfluorescensmikroskopi tillsammans med mikroinjektion av falloidin användas för att utvärdera de direkta och indirekta funktionerna av cytoplasmatiskt aktin i dess olika stadier av polymerbildning. Därför kan fluorescerande falloidin användas som ett viktigt verktyg i studiet av aktinnätverk med hög upplösning.
Användningar och begränsningar
Phalloidin är mycket mindre än en antikropp som vanligtvis skulle användas för att märka cellulära proteiner för fluorescensmikroskopi vilket möjliggör mycket tätare märkning av filamentöst aktin och mycket mer detaljerade bilder kan förvärvas särskilt vid högre upplösningar.
Omodifierade falloidiner tränger inte igenom cellmembranen, vilket gör dem mindre effektiva i experiment med levande celler. Derivat av falloidin med kraftigt ökad cellpermeabilitet har syntetiserats.
Celler behandlade med falloidiner uppvisar ett antal toxiska effekter och dör ofta. Dessutom är det viktigt att notera att falloidinbehandlade celler kommer att ha högre nivåer av aktin associerade med sina plasmamembran, och mikroinjektion av falloidin i levande celler kommer att förändra aktinfördelningen såväl som cellmotilitet.
Se även
|
Giftiga amanitasvampar _
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
|
Subgenus Amanita |
|
.jpg) |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Subgenus Amanitina |
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||