Clostridium difficile toxin A
| Toxin A- | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| identifierare | |||||||
| Organism | |||||||
| Symbol | toxA | ||||||
| Alt. symboler | tcdA | ||||||
| Entrez | 4914076 | ||||||
| RefSeq (Prot) | YP_001087137.1 | ||||||
| UniProt | P16154 | ||||||
| Övriga uppgifter | |||||||
| EG-nummer | 2.4.1.- | ||||||
| Kromosom | genom: 0,79 - 0,81 Mb | ||||||
| |||||||
,encoding_the_large_clostridial_toxins(LCTs)_involved_in_C._difficile_infections_CDI.png)
Clostridium difficile toxin A (TcdA) är ett toxin som genereras av Clostridioides difficile , tidigare känt som Clostridium difficile . Det liknar Clostridium difficile Toxin B . Toxinerna är de viktigaste virulensfaktorerna som produceras av de grampositiva , anaeroba Clostridioides difficile -bakterierna. Toxinerna fungerar genom att skada tarmslemhinnan och orsaka symtom på C. difficile -infektion, inklusive pseudomembranös kolit .
TcdA är ett av de största bakteriella toxiner som är kända. Med en molekylvikt på 308 kDa beskrivs det vanligtvis som ett potent enterotoxin , men det har också viss aktivitet som ett cellgift . Toxinet verkar genom att modifiera värdcellens GTPas-proteiner genom glukosylering, vilket leder till förändringar i cellulära aktiviteter. Riskfaktorer för C. difficile -infektion inkluderar antibiotikabehandling, som kan störa normal tarmmikrobiota och leda till kolonisering av C. difficile- bakterier.
tcdA -genen
Genen innehåller en öppen läsram (ORF) på 8 133 nukleotider , kodande för 2 710 aminosyror . TcdA och TcdB delar 63 % homologi i sina aminosyrasekvenser. Dessa gener uttrycks under sen log-fas och stationär fas som svar på miljöfaktorer. Miljöpåfrestningar som antibiotika och katabolitförtryck kan påverka uttrycket av toxiner.
Patogenicitet locus
tcdA- och tcdB - generna är belägna på Clostridioides difficile- kromosomen i ett 19,6-kb patogenicitetslokus (PaLoc) som endast finns i toxigena stammar av C. difficile . Icke-toxigena stammar innehåller ett fragment på 127 baspar som ersätter PaLoc. Detta lokus innehåller också tre andra accessoriska gener tcdC , tcdR och tcdE . TcdC- uttryck är högt under tidig exponentiell fas och avtar när tillväxten går in i stationär fas , i överensstämmelse med ökningar i tcdA- och tcdB -uttryck. Följaktligen har uttrycksmönster indikerat tcdC som en möjlig negativ regulator av toxinproduktion. tcdR kan fungera som en positiv regulator av toxinproduktion. tcdE har spekulerats för att underlätta frisättning av TcdA och TcdB genom lytisk aktivitet på bakteriecellmembranet. På grund av sin homologi med andra proteiner med liknande funktion, såväl som genens placering mellan tcdA och tcdB , förutspås tcdE fungera som det lytiska proteinet som underlättar frisättning eftersom TcdA och TcdB saknar en signalpeptid för utsöndring .
Strukturera
Proteinet innehåller tre domäner. Den N-terminala aminodomänen innehåller det aktiva stället , ansvarigt för toxinets glukosylerande aktivitet. Både TcdA och TcdB använder denna mycket konserverade N-terminala region (74 % homologi mellan båda toxiner) för att förändra identiska substrat .
Den C-terminala karboxidomänen innehåller upprepade enheter som är ansvariga för receptorbindning på målcellsytor. Dessa korta homologa repeterande enheter har benämnts kombinerad repetitiv oligopeptid (CROPs). En nyligen genomförd studie visar att CROPs bestämmer styrkan av TcdA genom interaktioner med strukturer på cellytan. Dessa CROP-regioner sträcker sig från 21-50 rester och spelar en roll i receptorbindning. Denna C-terminala repetitiva region betecknas som den immundominanta regionen eftersom ligandbindning kan blockeras av monoklonala antikroppar specifika för denna region. Denna region innehåller den mest hydrofila delen av molekylen.
En centralt belägen hydrofob domän innehållande ett kluster av 172 högkonserverade hydrofoba aminosyror tros vara viktig för translokation av den enzymatiska delen av proteinet.
Handlingsmekanism
TcdA måste internaliseras i värdcellen via endocytos för att komma åt cytosolen . Receptorbindning är det första steget som krävs för att komma in i cellen via endocytos i en sur endosom . Lågt pH i endosomen inducerar strukturella förändringar såsom exponering av de hydrofoba domänerna som är avgörande för TcdA-funktionen.
Den N-terminala domänen av TcdA fungerar för att katalysera en glukostransferasreaktion, som överför en glukosmolekyl från UDP-glukos och kovalent binder den till konserverade aminosyror i målmolekyler. Därför katalyserar TcdA glukosylering och den efterföljande irreversibla inaktiveringen av målmolekyler i Ras-familjen av små GTPaser. Dessa målmolekyler inkluderar RhoA , Rac och Cdc42 , som är regulatoriska proteiner i det eukaryota aktincytoskelettet och modulatorer av många olika cellsignaleringsvägar .
Intracellulära mål
TcdA riktar sig främst till Rho , Rac och Cdc42 . Dessa molekyler är viktiga regulatorer av cellsignalering. Små GTPaser som Rho, Rac och Cdc42 reglerar sin aktivitet genom att växla mellan ett aktivt GTP -bundet tillstånd och ett inaktivt GDP -bundet tillstånd. Guaninutbytesfaktorer (GEF) reglerar utbytet av GTP och BNP .
TcdA glukosylerar RhoA genom att överföra en glukosmolekyl från UDP-glukos , ett nukleotidsocker, till Thr-37 i RhoA GTPas. I Rac och Cdc42 överförs sockerdelen till Thr-35. Glukosyleringen förhindrar korrekt bindning av GTP och blockerar aktivering. TcdA verkar företrädesvis på den GDP-bundna formen av GTPas-proteinerna eftersom denna konfiguration exponerar treoninresten som glukosyleras av toxinet.
RhoA reglerar aktincytoskelettet och bildar stressfibrer och fokala vidhäftningar . När RhoA inaktiveras via TcdA hämmas dess interaktion med effektorer nedströms. Detta leder till förändringar i aktincytoskelettet som ökar permeabiliteten i tarmepitelet . Rac och Cdc42 är involverade i filopodiumbildning som är avgörande för rörelse och cellmigration. Sammantaget Rho , Rac och Cdc42 alla processer i celler som är beroende av aktinpolymerisation. Många av de fysiologiska effekterna som celler upplever efter exponering för TcdA kan kopplas till oreglering av aktinpolymerisation och cellulära vägar kontrollerade av TcdA-mål.
Fysiologiska effekter
Cellmorfologi
Exponering för TcdA leder till omedelbara förändringar i cellmorfologi, inklusive förlust av strukturell integritet på grund av en minskning av filamentöst aktin ( F-aktin ) och en ökning av globulärt aktin . Oorganisering av aktinfilament och cytoskelettet leder till ökad permeabilitet av täta förbindelser vilket resulterar i allvarlig epitelcellsskada och vätskesekretion. Vätskeansamling och utsöndring är sekundärt till slemhinneskada som uppstår efter exponering för TcdA. Distinkta förändringar i mikrofilamentsystemet leder till cellavrundning och celldöd. Dessa förändringar är resultatet av inaktiveringen av Rho -proteiner, som spelar en viktig roll för att reglera tight junctions .
Apoptos
Apoptos är den mest sannolika mekanismen som förklarar döden av celler exponerade för TcdA. Rho- inaktivering kan aktivera kaspas-3 och kaspas-9 ; två nyckelkomponenter i den apoptotiska vägen. TcdA har kopplats till mitokondriella membranavbrott och frisättning av cytokrom C genom kaspasaktivering och Rho- inaktivering, vilket ytterligare tyder på att TcdA kan inducera apoptos.
Klinisk signifikans
Clostridioides difficile associerad diarré (CDAD)
Djurmodeller har visat att TcdA inkluderar diarré, neutrofilinfiltration , inflammation i tarmslemhinnan och nekros av epitelceller . Detta toxin anses vara den främsta orsaken till CDAD. TcdA skadar tarmspetsar, vilket stör borstens kantmembran , vilket leder till cellerosion och vätskeläckage från det skadade området. Denna skada och associerade vätskesvar orsakar diarré i samband med Clostridioides difficile -infektion.
Pseudomembranös kolit
TcdA kan inducera de fysiologiska förändringarna som inträffar i C. difficile -relaterad pseudomembranös kolit (PMC), en allvarlig sårbildning i tjocktarmen. Toxinskada på tjocktarmens slemhinna främjar ansamlingar av fibrin , mucin och döda celler för att bilda ett lager av skräp i tjocktarmen (pseudomembran), vilket orsakar en inflammatorisk respons . TcdA-skada orsakar ökad epitelpermeabilitet, cytokin- och kemokinproduktion , neutrofilinfiltration, produktion av reaktiva syrearter (ROS), mastcellaktivering och direkt skada på tarmslemhinnan. Alla kan tillskrivas TcdA-inducerad inaktivering av Rho GTPase- proteiner. Förlust av tight junctions kan ge inträde för neutrofiler i tarmarna, vilket leder till neutrofil ackumulering; ett kännetecken för PMC. TcdA-inducerad cytokinproduktion av IL-8 och andra inflammatoriska mediatorer bidrar till de stadier av inflammation som ses i PMC. Infiltration av neutrofiler, makrofager och mastceller som svar på TcdA-skada ökar det inflammatoriska svaret genom produktion och frisättning av andra mediatorer såsom tumörnekrosfaktor alfa, IL -1 , IL-6 och andra monokiner . Dessa mediatorer orsakar ytterligare skador på tarmslemhinnan och ökar det inflammatoriska svaret ytterligare, vilket påverkar PMC-persistens. Om omfattande skador på tarmväggen uppstår kan bakterier komma in i blodomloppet och orsaka septisk chock och död.
Toxin upptäckt och diagnos
TcdA och TcdB finns i supernatantvätskor från Clostridium difficile- kulturer och kan renas från filtrat. Båda toxiner detekteras konsekvent i fekala prover från människor och djur och används nu som markörer för att diagnostisera C. difficile -infektion. Över 90 % av patienterna infekterade med C. difficile visade sig ha cytotoxisk aktivitet i avföringen. Glukosylering av Rho GTPaser inaktiverar GTPase-proteinerna, vilket leder till kollaps av cytoskelett, vilket resulterar i cellavrundning. En vävnadsodlingsanalys har utvecklats för att detektera C. difficile -toxiner i avföringsprover. En cellavrundningsanalys (cytotoxicitetsanalys) har utvecklats för att diagnostisera C. difficile -infektion. Enzym-linked immunosorbent assays (ELISA) har använts för att detektera TcdA och TcdB med specifika antikroppar . När den används med en ELISA är cytotoxicitetsanalysen "guldstandarden" när den används på Vero-celler för C. difficile -diagnos.
Betydelsen av TcdA och TcdB vid C. difficile -infektion
Sedan 1980-talet och början av 1990-talet har rollerna för TcdA och TcdB vid C. difficile- infektion diskuterats mycket. Tidigare rapporter med renade toxiner indikerade att TcdA enbart var tillräckligt för att orsaka symtom på infektion och TcdB kunde inte göra det om det inte kombinerades med TcdA. Ett nyare experiment visade att TcdB i själva verket var avgörande för virulens . Tidigare forskning fastställde TcdA strikt som ett enterotoxin och TcdB som ett cellgift , men senare visade sig båda toxinerna ha samma verkningsmekanism. För att fullständigt undersöka rollen av båda toxinerna i patogenesen av C. difficile- infektion, utvecklades ett gen-knockout-system i en hamsterinfektionsmodell. Genom att permanent slå ut tcdA , tcdB eller båda (dubbel knockout) visades det att C. difficile som producerade ett eller båda toxiner kunde ha cytotoxisk aktivitet, och denna aktivitet översattes direkt till virulens in vivo . Det visade sig också att en dubbel tcdAtcdB knockout var helt försvagad i virulens . Sammantaget har denna forskning visat betydelsen av både TcdA och TcdB vid C. difficile -infektion, vilket visar att båda toxinerna är kapabla till cytotoxicitet.
