Intracellulär leverans

Intracellulär leverans genom virala vektorer, icke-virala bärare och membranavbrott. Membranavbrottsmedierad leverans kan introducera olika material genom direkt penetrering eller permeabiliseringsmekanismer. Virala vektorer kan leverera DNA eller RNA genom ingenjörskonst. Icke-virala nanobärare har mestadels använts för nukleinsyraleverans men kan också utformas för leverans av mer olika material.

Intracellulär leverans är processen att införa externa material i levande celler. Material som levereras till celler inkluderar nukleinsyror ( DNA och RNA ), proteiner , peptider , ogenomträngliga små molekyler , syntetiska nanomaterial , organeller och mikronskaliga spårämnen, enheter och föremål. Sådana molekyler och material kan användas för att undersöka cellulärt beteende, konstruera celloperationer eller korrigera en patologisk funktion.

Medicinska tillämpningar av intracellulär leverans sträcker sig från in vitro fertilisering (IVF) och mRNA-vacciner till genterapi och beredning av CAR-T-celler . Industriella tillämpningar inkluderar proteinproduktion , biotillverkning och genteknik av växter och djur. Intracellulär leverans är en grundläggande teknik i studiet av biologi och genetik, såsom användningen av DNA-plasmidtransfektion för att undersöka proteinfunktion i levande celler. Det finns ett brett utbud av tillvägagångssätt för att utföra intracellulär leverans inklusive biologiska, kemiska och fysikaliska tekniker som fungerar genom antingen membranavbrott eller förpackning av leveransmaterialet i bärare.

Intracellulär leverans är i skärningspunkten mellan cellbiologi och teknologi och är relaterad till många områden inom vetenskap och medicin inklusive genetik , bioteknik , bioteknik och läkemedelsleverans .

Ansökningar

Tillämpningar av intracellulär leverans. Beroende på insatsmaterial som levereras till cellerna kan olika resultat eller tillämpningar uppnås. TCR = T - cellsreceptor , CAR = chimär antigenreceptor , HSC = hematopoetiska stamceller , CNT = kolnanorör

Analogt med hur datorer fungerar genom elektroniska signaler, bearbetar och överför celler information genom molekyler. Beroende på molekylerna och materialen som laddas in i cellerna kan olika resultat eller tillämpningar uppnås (se figur "Applikationer för intracellulär leverans" för exempel). Nedan är några av huvudklassificeringarna av lastmaterial som används för att undersöka och konstruera celler genom intracellulär leverans.

Lasttyper

Nukleinsyror

Transfektion hänvisar till intracellulär leverans av nukleinsyror: DNA , RNA och deras analoger . Nukleinsyramaterial som vanligtvis transfekteras in i celler är plasmid-DNA , mRNA , siRNA och oligonukleotider . Transfektionsapplikationerna spänner över tre huvudområden:

  1. Grundläggande biologisk forskning ,
  2. biotillverkning , och
  3. gen- och cellbaserade terapier

. Inom grundforskning är transfektion en hörnstensteknik inom områden som sträcker sig från cellbiologi och genetik till immunologi och läkemedelsupptäckt . Inom biotillverkning används transfektion för produktion av proteiner, antikroppar, virala vektorer och virusliknande partiklar för vacciner. I cellbaserade terapier används transfektion för tillämpningar som ex-vivo-genterapi, hematopoetisk stamcellsteknik , produktion av inducerade pluripotenta stamceller och ex-vivo-preparering av celler för immunterapi . Under de senaste 50 åren har nukleinsyratransfektion varit vanligaste underkategorin för intracellulär leverans.

Plasmid-DNA började transfekteras in i djurceller för genuttryck i slutet av 1970-talet via mikroinjektion och kalciumfosfatmetoder. Sedan dess har det använts för att undersöka gen- och proteinfunktion i många studier. DNA-plasmider är fysiskt stora och besvärliga molekyler med en plasmid på 5-10 kilo baspar som är >100 nm i diameter i lösning när den är fri och okondenserad. Ändå, på grund av de väletablerade och relativt billiga teknikerna för att redigera och förbereda dem, har de använts mycket ofta inom biologisk forskning.

På 1970-talet visades det att mikroinjektion av mRNA resulterade i proteinuttryck. I vissa situationer anses mRNA-transfektion vara fördelaktig för att inducera proteinuttryck jämfört med DNA-plasmider på grund av följande skäl

  1. minskad risk för genomisk integration,
  2. kräver inte nukleär leverans med cytosolisk tillförsel som är tillräcklig,
  3. proteinuttryck är dosberoende och snabbt,
  4. mindre toxiska och immunogena än DNA-vektorer när de är lämpligt kemiskt modifierade.

Således anses mRNA vara ett bättre alternativ än DNA för de flesta terapeutiska tillämpningar även om det är dyrare och i sig instabilt.

Oligonukleotider är enkel- eller dubbelsträngade sekvenser av DNA eller RNA som är mindre än 30 nukleotider långa. Små interfererande RNA (siRNA) är korta 21-22 baspar duplex av RNA som kan transfekteras in i celler för att tysta genuttryck . Sedan deras Nobelprisvinnande upptäckt 1998 har siRNA transfekterats till celler i tusentals biologiska studier för att störa genens funktion. Andra oligonukleotider av intresse för intracellulär leverans inkluderar antisensoligonukleotider (ASO), mikro-RNA (miRNA) och aptamerer . Sådana oligonukleotider kan användas för att förändra cellbeteende genom flera olika mekanismer.

Lipidnanopartiklar och elektroporering är för närvarande utbredda strategier för nukleinsyratransfektion . Effektiv transfektion förblir dock ett hinder i många primära celler , stamceller , patienthärledda celler och neuroner . Förmågan att bedriva biologisk forskning och utföra potentiella medicinska tillämpningar i sådana celler begränsas ofta av transfektionseffektivitet och tolerans mot behandling. Dessutom finns det för närvarande en dålig förståelse för de långsiktiga effekterna av att utföra transfektion på celler i människokroppen.

Proteiner och peptider

Leverans av proteiner till levande celler, såsom genomredigerande nukleaser , aktiva hämmande antikroppar eller stimulerande transkriptionsfaktorer , representerar ett kraftfullt verktyg för att manipulera och analysera cellfunktion. Dessutom kan effektiv intracellulär leverans utöka repertoaren av användbara proteinläkemedel eftersom de flesta nuvarande proteinbaserade terapier träffar extracellulära mål och detta är en frontlinje för nuvarande forskningsinsatser.

Leverans av renade proteiner till celler började redan på 1960-talet. Exempel inkluderar amöba mikroinjicerade med ferritin och musägg mikroinjicerade med bovint albumin . Eftersom proteiner har olika storlek, form och laddning, kan de inte enkelt levereras till celler med en enda storlek som passar alla lösningar som katjoniska lipider använder för nukleinsyratransfektion. Däremot har en mängd olika metoder använts för att leverera proteiner till celler inklusive: mikroinjektion , osmotisk lys av pinosomer, hypotonisk chock, skrapladdning, pärlladdning, sprutladdning, rengöringsmedelsexponering , elektroporering , porbildande toxiner , cellpenetrerande peptider , nanobärare, cellklämning, nanonålar, akustiska störningar och ångnanobubblor. För genomredigering Cas9-protein kombinerat med sgRNA levererats med metoder som sträcker sig från elektroporering, mikroinjektion, lipidnanopartikelformuleringar, osmotiskt inducerad endocytos följt av endosomavbrott, mikrofluidisk deformation och cellpenetrerande peptider bland annat.

Små molekyler

Små molekyler som kräver intracellulär leverans inkluderar:

  1. ogenomträngliga småmolekylära läkemedel ,
  2. små molekylsonder, och
  3. kryoskyddsmedel .

Ett exempel på det förra är bleomycin , ett läkemedel mot cancer med dålig permeabilitet på grund av dess positiva laddning och hydrofobicitet. Genom att utföra intracellulär leverans med elektroporering kan bleomycinstyrkan ökas mer än hundra gånger. När det gäller sonder av små molekyler, när de levereras till cellens inre, kan dessa molekyler rapportera cellulära egenskaper såsom membranpotential, pH och jonkoncentrationer. Ett exempel är PFBI, ett fluorescerande färgämne som kan användas för mätning av intracellulär kaliumkoncentration. Slutligen är vissa kryoskyddande kandidatmolekyler såsom ogenomträngliga sockerarter mycket hydrofila och diffunderar inte färdigt över cellmembranen. Till exempel trehalos (Mw = 342 Da) en naturlig disackarid som syntetiseras av en rad organismer för att hjälpa dem att motstå uttorkning eller frysning. Trehalos laddad i djurceller i koncentrationer upp till 200 mM har visat sig ge utmärkt kryoskydd under frysning och upptining.

Microscale Cargo

Lastmaterial i mikroskalan har framgångsrikt levererats till celler för en mängd olika applikationer. Under ett sekel har mikroinjektion varit den dominerande metoden för att introducera last i mikroskala i celler. Ett klassiskt exempel var transplantationen av en somatisk cellkärna till ett grodägg för att visa att kärnor från helt differentierade somatiska celler kunde växa till ett nytt djur när de sätts in i ett ägg. Mikroinjektion användes först för att injicera spermier i ägg som ett proof of concept för IVF hos djur. Konstgjorda kromosomer har konstruerats och överförts till celler genom mikroinjektion för proof-of-concept genterapi. Transplantation av mitokondrier har också påvisats i flera celltyper via mikroinjektion. På senare tid har laserutlösta kavitationsbubblor använts för att öppna övergående hål i cellmembranet i syfte att leverera bakterier och mitokondrier. Med hjälp av mikroinjektion eller ballistisk framdrivning har partiklar, sfärer och pärlor i mikronskala laddats in i celler för cellulära mikroreologistudier som bedömer cellers inre mekaniska beteende. Till exempel, med användning av mikroinjicerade PEGylerade spårpärlor på upp till 5,6 mikron, visades det att motordriven cytoplasmatisk blandning avsevärt förbättrade intracellulär rörelse av både små och stora cellulära komponenter.

Andra

Andra material av intresse för intracellulär leverans inkluderar kolnanorör , kvantprickar , magnetiska nanopartiklar och nanoenheter som fungerar som sensorer eller sonder

Egenskaper hos vanliga molekyler av intresse för intracellulär leverans
Material Storlek (enheter) Cirka. massa (Da) Mått i lösning (nm) Ladda vid neutralt pH
Små molekyler N/A < 900 Da <1 nm variabel; ofta neutral för att främja permeabiliteten
Peptider <40 aminosyror ~110 Da per aminosyra 0,2-3 nm varierar beroende på aminosyrasammansättning
Proteiner 20 - 1000-tals aminosyror ~110 Da per aminosyra ~2 - 25 nm varierar beroende på aminosyrasammansättning
Cas9 ribonukleoprotein (RNP) ~1400 aminosyror + 100 baser RNA ~188 kDa (~158 kDa protein + ~30 kDa RNA) ~12 - 15 nm ~ -80 (+22 protein, -100 sgRNA)
Antisensoligonukleotid (ASO ) 13 - 25 baser (enkelsträngad) 4-8 kDa längd: 4 - 8 nm om linjär -1 per bas
siRNA / miRNA 21 - 23 baspar 13 - 15 kDa 2 nm bred x 7,5 nm lång -1 per bas
mRNA 0,5 - 10 kilo-baser RNA (enkelsträngat) ~320 Da per bas tiotals till hundratals nm -1 per bas
plasmid-DNA 0,5 - 10 kilo baspar DNA (dubbelsträngat) ~650 Da per bas hundratals nm; beror på supercoiling -1 per bas

Medicinska tillämpningar

Följande är exempel på medicinska behandlingar som är beroende av intracellulär leverans i minst ett steg.

Hematopoetiska stamcellsbaserade genterapier :

CAR-T- cellsimmunterapier :

In vivo viral vektormedierad genterapi :

  • Onasemnogen Abeparvovec (märkt som Zolgesma) för behandling av spinal muskelatrofi , administrerat genom intravenös infusion av en AAV9-viral vektor som levererar en funktionell SMN1- transgen till de drabbade motorneuronerna (amerikanskt godkännande beviljat 2019).
  • Voretigene neparvovec (märkt som Luxturna) för behandling av Leber congenital amaurosis (en ärftlig retinal sjukdom som orsakar progressiv blindhet), administrerad genom subretinal injektion av en AAV2 viral vektor som levererar en funktionell kopia av RPE65- genen till ögonceller för att kompensera för RPE65 mutation (amerikanskt godkännande beviljat 2017).

siRNA läkemedel:

  • Patisiran (Onpattro) för behandling av polyneuropati hos personer med ärftlig transtyretinmedierad amyloidos , administrerat genom intravenös infusion av siRNA formulerat till lipidnanopartiklar som tar sig in i leverceller för att tysta uttrycket av patogent transtyretin- mRNA (USA och europeiskt godkännande beviljat 2018) .
  • Givosiran (Givlaari) för behandling av vuxna med akut leverporfyri , administrerat genom intravenös infusion av siRNA-GalNAc-konjugat som tar sig in i leverhepatocyter för att tysta uttrycket av patogent aminolevulinatsyntas 1 (ALAS1) mRNA (amerikanskt godkännande beviljat) .

mRNA-vacciner :

av covid spike protein för att förbereda immunsystemet mot framtida exponering för SARS-CoV-2 .

Antisensoligonukleotider (ASOs) :

ASO:erna kommer in i leverceller för att förhindra uttryck av patogent ApoB -mRNA (USA:s godkännande beviljat 2013).

In vitro fertilisering (IVF) för mänskliga graviditeter:

  • I fall som lågt antal spermier eller rörlighet, eller där ägg inte lätt kan penetreras av spermier, kan enstaka spermier mikroinjiceras direkt i ägget med en procedur som kallas intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI). Efter injektionen inkuberas det befruktade ägget i ett speciellt tillväxtmedium i cirka 48 timmar tills ägget består av sex till åtta celler. Det överförs sedan till patientens livmoder genom en tunn plastkateter, som går genom slidan och livmoderhalsen . Den första mänskliga graviditeten som genererades av ICSI utfördes 1991 av Gianpiero Palermo och hans team. IVF genom ICSI har underlättat miljontals graviditeter över hela världen sedan 1990-talet.

Säkerhet. Forskning är fortfarande i ett tidigt skede av att förstå de omedelbara och långsiktiga medicinska effekterna av intracellulär leverans av material till mänskliga celler. Till exempel har undersökningar visat att barn som föds genom ICSI lider av fler hälsoproblem än de som är naturligt avlade. Det är dock inte känt om detta beror på sämre hälsa hos föräldrarnas reproduktionssystem eller aspekter av IVF- och ICSI-proceduren. HSC-baserade genterapier framställda med gamma retrovirala och lentivirala vektorer har i vissa fall visat en ökad risk för leukemi på grund av genotoxicitet, vilket inträffade med Strimvelis. Dessutom kan de lipider som används för intracellulär leverans av terapeutiskt siRNA och mRNA orsaka inflammatoriska reaktioner. När det gäller patisiran används förbehandling med flera antiinflammatoriska läkemedel för att minimera reaktioner på nanopartikeln. Det finns för närvarande få data tillgängliga om den medicinska effekten av intracellulär leverans av nya kemiska komponenter i mRNA-vacciner, såsom SM-102 och ALC-0315, på både kort- och långsiktig hälsa hos mottagarpopulationen. Säkerhet och oavsiktliga biverkningar kommer således att fortsätta att vara ett viktigt ämne för medicinska behandlingar som använder intracellulär leverans.

Kategorier av metoder

Metoder för intracellulär leverans kartlade till mekanism. Metoder är kopplade till deras verkningsmekanism, som är 1) permeabilisering, 2) direkt penetration, 3) endocytos eller 4) fusion. Vissa metodkategorier kan fungera genom flera mekanismer (t.ex. vissa porbildande toxiner inducerar endocytos och efterföljande endosomstörning medan andra övergående permeabiliserar plasmamembranet). De flesta av de fysikaliska metoderna är membranstörande medan de flesta av de biokemiska metoderna är bärarförmedlade.

Nuvarande metoder för intracellulär leverans kan delas in i två breda kategorier:

  1. Membranstörning-medierad
  2. Bärarförmedlad

Membranstörning




Membranavbrottsmedierade tekniker innebär att man skapar tillfälliga hål i cellmembranet och levererar lastmolekylerna via antingen A) Permeabilisering och diffusivt inflöde av material från den extracellulära lösningen B) Direkt penetration med en vehikel eller bärare som både punkterar plasmamembranet och introducerar last av intresse. Cellens plasmamembran kan störas genom mekaniska, elektriska, kemiska, optiska eller termiska medel. Intracellulära leveransmetoder som använder permeabilisering inkluderar:

Intracellulära leveransmetoder som använder direkt penetration inkluderar:

  • Klassisk mikroinjektion
  • Nyare former av mikroinjektion (t.ex. Nanopipette, Automation etc.)
  • Ballistiska partiklar / genpistol
  • Nanoneedles och deras variationer såsom Nanostraws, Nanospears och Nanowires .

Membranavbrottsmedierade leveransmetoder kan leverera nästan vilket material som helst som kan dispergeras i lösning, vilket gör dem mer universella än bärarmedierade metoder. Den stora utmaningen för membranavbrottsmedierade metoder är att skapa hål med optimal form, storlek, placering och varaktighet för den erforderliga leveransapplikationen. Överdriven membranskada bör undvikas eftersom det kan döda celler eller försämra deras funktion.

Historiska milstolpar i utvecklingen av intracellulära leveransmetoder och deras tillämpningar. Referenser finns i recensionspublikationer.

Bärare

Bärarförmedlade leveranstekniker packar lasten i eller på en nanoskalabärare, som sedan går in i cellen för att leverera lasten. Bärare kommer i allmänhet in i cellens inre via antingen

  1. Endocytos (de flesta bärare) eller
  2. Fusion med cellens plasmamembran

Det finns dock sällsynta rapporter om vissa bärare som korsar eller övergående stör plasmamembranet genom hittills okända mekanismer.

Bärarbaserade tillvägagångssätt omfattar olika biokemiska sammansättningar, mestadels av molekylära dimensioner till nanoskala. Syftet med transportörer är trefaldigt,

  1. att packa lasten och skydda den från nedbrytning,
  2. för att få tillgång till det avsedda intracellulära utrymmet, och
  3. för att frigöra nyttolasten vid lämplig tidpunkt och plats.

Bärare kan vara bioinspirerade, såsom rekonstituerade virus, virusliknande partiklar , vesikler , cellspöken och funktionella ligander och peptider . De kan baseras på syntestekniker från kemi , materialvetenskap och nanoteknologi , som involverar sammansättning av makromolekylära komplex från organiskt och oorganiskt ursprung. Bärare som har använts för intracellulär leverans inkluderar:

Forskning om hur bärare kommer in i celler tyder på att de flesta bärare kommer in via endocytos innan de flyr från endosomala avdelningar in i cytoplasman . Mekanismer för endocytos som är tillgängliga för nanobärare inkluderar fagocytos och pinocytos genom klatrinberoende och klatrinoberoende vägar. De internaliseringsvägar som används av målceller beror på storlek, form, materialsammansättning, ytkemi och/eller laddning av bäraren. Last som inte kan fly från endosomer transporteras till lysosomer för nedbrytning eller återvinns tillbaka till cellytan. Effektiviteter på cirka 1% endosomala flykt har rapporterats för de flesta icke-virala bärarstrategier, inklusive lipidnanopartiklar och cellpenetrerande peptider. Dessutom är de exakta mekanismerna för endosomflykt fortfarande oklara och är en fråga om pågående forskning.

Förutom endocytos kan vissa bärare direkt smälta samman med plasmamembranet genom fusion. Fusionshändelser inom biologi inkluderar vesikelfusion, cell-cell-fusion och cell-virus-fusion. I dessa fall dras intilliggande membran i nära kontakt av specifika protein-protein-interaktioner och gränssnittsvatten utesluts för att främja lipidblandning och efterföljande fusion. Höljeförsedda virus kan använda transmembrana virala proteiner för att förmedla fusion med målcellsmembran och denna mekanism har utnyttjats för konstruerad intracellulär leverans. Ett tidigt exempel var användningen av sendai-virus för att smälta ihop förladdade röda blodkroppsspöken med plasmamembranet hos målceller. En variant av denna teknik använde uttryck av influensahemagglutinin (HA) vid målcellsmembranet, som sedan binder sialinsyrarester på ytan av röda blodkroppar för att inducera fusion. Virosomer , som består av virala membrankomponenter rekonstituerade till liposomer eller vesiklar, uppvisar också fusionsförmåga för syftet med intracellulär leverans. Funktionella virosomer har konstruerats med fusionskomponenter från sendai , influensa , vesikulär stomatit och andra virus. Vissa exosomer och extracellulära vesiklar har rapporterats smälta samman med målceller och kan dessutom vara konstruerade för att smälta ihop vid behov. Intressant nog har fusogena liposomer som används för proteintillförsel rapporterats vara kapabla till fusion genom att modulera endast lipidkompositionen utan något behov av närvaron av fusogena proteiner eller peptider. Fusogena bärare som har använts för intracellulär leverans inkluderar



(1) cellspöken, döda celler som har fått sin cytoplasma ersatt med last, (2) virosomer , lastladdade vesiklar rekonstituerade för att visa funktionella virala proteiner och (3) fusogena liposomer .

Virala vektorer . Virala vektorer utnyttjar virusinfektionsvägen för att komma in i celler men undviker efterföljande uttryck av virala gener som leder till replikation och patogenicitet . Detta görs genom att radera kodande regioner av det virala genomet och ersätta dem med det DNA som ska levereras, som antingen integreras i värdkromosomalt DNA eller existerar som en episomal vektor. Virala vektorer användes först för genleverans från 1970-talet, konstruerade från SV40 eller retrovirus . Nyare generationer av virala vektorplattformar har producerats baserade på komponenter från lentivirus , retrovirus , adenovirus eller adenoassocierat virus och andra virus. Även om de är mycket effektiva för DNA-leverans, är anmärkningsvärda svagheter hos virala vektorer (1) arbetsintensiva och dyra protokoll, (2) säkerhetsproblem, (3) risk för att orsaka immun-/ inflammatoriska svar , (4) integration i genomet med rekombinanta vektorer , (5) risk för insättningsgentoxicitet och (6) begränsad förpackningskapacitet (Adeno och AAV begränsas vanligtvis till att bära 5–7,5 kb).

Nanopartiklar för transfektion . De vanligaste nanopartiklarna för intracellulär leverans av nukleinsyror är baserade på sammansättningar av katjoniska lipider och polymerer. Dessa katjoniska molekyler kondenserar DNA-plasmider (~50-200 nm), mRNA (10-100 nm) och andra nukleinsyror (se "Egenskaper hos vanliga molekyler av intresse för intracellulär leverans") till kompakta nanopartiklar med dimensioner ner till tiotals nanometer. Den positiva laddningen av dessa partiklar underlättar deras attraktion till cellytan på grund av den naturliga negativa laddningen hos de flesta djurceller (-35 till -80 mV membranpotential ). Vid bindning anses endocytos vara mest effektiv för partiklar i storleksintervallet under 100 nm. Komplexbildning till nanopartiklar ger också skydd för nukleinsyror mot nedbrytning tills de frigörs till lämpligt intracellulärt utrymme.

Från 1960-talet observerades att blandning av nukleinsyror med katjoniska molekyler leder till bildandet av makromolekylära komplex som kan transfektera celler. Två tidiga exempel var kombinationen av polymeren dietylaminoetyl- dextran (DEAE-dextran)/nukleinsyra (1968) och det olösliga joniska saltet kalciumfosfat / nukleinsyrafällning (1973). Användningen av katjoniska lipider för transfektion började på 1980-talet, kallades " lipofection ", och blev grunden för den populära produkten lipofectamine som lanserades 1993. Andra katjoniska transfektionsreagens utvecklades på 1990-talet baserat på dendrimerer som PAMAM 1993 (“ superfekt" reagens som lanserades i slutet av 1990-talet) och katjoniska polymerer som PEI 1995 (marknadsförs som "polyjet" strax efter). För närvarande inom forskning utförs de flesta nukleinsyratransfektion med lipidereagens, med polymerreagens och elektroporering som andra stora alternativ. Vissa motsträviga celler eller in vivo -applikationer kan vara bättre lämpade för virala vektorer.

Tekniska framsteg

Förbättrad precision av membranstörningar

Illustration av hur bulk-, mikro- och nanoskalateknik har tillämpats för att förbättra precisionen av elektriska, mekaniska och termiska lägen för membranstörningar-baserad intracellulär leverans. Material som ska levereras visas som röda prickar.

Framsteg inom mikrotillverkning , nanoteknik , kemi och andra forskningsområden har bidragit till förbättringarna av precision och prestanda hos intracellulära leveransmetoder.

Elektroporation . Tidiga versioner av elektroporering använde bulkelektroder för att applicera elektriska pulser av definierad spänning till celler i lösning i en kyvett . Elektroporation fördes sedan ner till mikroskalan genom användning av mikrofluidik i slutet av 90-talet. Därefter uppnåddes nanoelektroporering genom användning av nanoöppningar och nanohalm. Nano- och mikroversionerna av elektroporering har mycket högre precision och kontroll över storleken och placeringen av membranstörningar som utsätts för målceller. Ett företag som heter Maxcyte har utvecklat en version med hög genomströmning av flödeselektroporering som kan behandla hundratals miljoner celler på tiotals minuter. Dessutom har andra forskargrupper använt djupinlärning för att förbättra elektroporationsparametrar i flerbrunnssystem med hög genomströmning.

Mekanisk kontakt . De första versionerna av intracellulära leveransprotokoll som utnyttjade den mekaniska kraften hos föremål som träffade cellmembranet var enkla och grova metoder som skrapladdning och glaspärlor. Vid skrapladdning, till exempel, dras en spatel över vidhäftande celler som har odlats på ett plant substrat. När cellerna skalar av substratet genomgår de en varierande mängd membranskador och kan ta upp molekyler i lösning. Skrapning och pärlladdning har använts i många biologiska studier för att introducera proteiner och små molekyler i celler.

Sedan slutet av 1990-talet har forskare arbetat för att förbättra precisionen för fasta kontraktsbaserade membranavbrott genom användning av nanonålar och mikrotillverkade enheter. Nanonålar användes först för nukleinsyratransfektion 2003 och visade sedan leverans av olika laster 2010. De har kombinerats med elektroporering, flödesbehållare och rengöringsmedel för att lägga till mer funktionalitet. Dessutom har nanostrån använts för att både infoga och extrahera molekyler i celler på ett tidsupplöst sätt.

År 1999 fann man att passerande av celler genom hål i polykarbonatfilter skapade tillfälliga störningar i cellmembranet för att uppnå DNA-transfektion. Metoden kallades "filtroporation" och fick inte mycket uppmärksamhet vid den tiden. År 2012 fann forskare vid MIT att att passera celler genom förträngningar i kiselmikrofluidiska enheter kunde störa cellmembranet för att uppnå intracellulär leverans av olika material. Metoden, kallad cell squeezing, spreds ut till ett företag som heter SQZ biotech som fokuserar på att utnyttja intracellulär leveransteknologi för att utveckla cellbaserade terapier . Genom att justera cellernas flödeshastighet och formen och storleken på mikrofluidisk förträngning, kan cellklämning skräddarsys för olika celltyper och leveransapplikationer. Andra forskargrupper har demonstrerat cellklämningskonceptet i mikrosilar och PDMS-baserade mikrofluidenheter.

Cellklämning har kombinerats med elektroporering för att uppnå snabb leverans av DNA och andra material in i kärnan . Detta fungerar genom att först införa hål i plasmamembranet och sedan låta en elektrisk puls tjäna till att 1) ​​störa kärnmembranet och 2) driva negativt laddade nukleinsyror in i cellen. Mikrofluidisk cellklämning följt av nedströms elektroporering har visat sig orsaka tillfälliga störningar i kärnmembranet som reparerades inom 15 minuter.

Vätskeskjuvning . Tidiga exempel på att använda vätskeskjuvkrafter för att kontrollera att bryta cellmembranet inkluderar konventionellt ultraljud , sprutladdning för celler i suspension och användning av konplattviskometer på vidhäftande celler. Vid laddning av sprutor sugs suspensioner av celler ut och stöts ut från en spruta genom en fin nålspets. Vätskeskjuvkrafterna vid spetsen av nålen beror på flödeshastigheten och kan skräddarsys för att störa cellmembranet. Sedan 1990-talet inkluderar mer exakta strategier för att använda vätskeskjuvkrafter för att permeabilisera celler mikrofluidik , ultraljud , stötvågor och laserbaserade metoder.

Laserbestrålning av ett absorberande föremål i en vattenhaltig miljö kan ge en mängd olika effekter inklusive kavitation , plasmaproduktion , kemiska reaktioner och värme. Både laser-partikel- och laser-yta-interaktioner har utnyttjats för att skapa kavitationshändelser som exponerar celler för lokalt koncentrerade vätskeskjuvkrafter. Till exempel kan en metallisk nanostruktur användas som en fröstruktur för att skörda kort laserpulsenergi och omvandla den till mycket lokaliserade explosiva ångbubblor. En version med hög genomströmning av detta koncept presenterades 2015. Substrat med porer kantade av metalliska absorbenter bestrålades för att generera exploderande kavitationsbubblor under bassidan av vidhäftande celler. Membranpermeabilisering synkroniserades med aktiv pumpning av last genom porerna för att framgångsrikt introducera levande bakterier (>1 mikron) i cytoplasman hos flera celltyper.

Termiska effekter . Ett enkelt sätt att leverera molekyler till celler är att värma plasmamembranet tills det bildas hål. Vid tillräckligt höga temperaturer kommer lipiddubbelskikt att dissociera på grund av att kinetisk energi hos de ingående molekylerna är större än krafterna som upprätthåller membranbildningen, nämligen de hydrofoba krafterna som stöter bort vatten från lipidsvansarna. Nackdelen med denna metod är att den är otroligt ospecifik och kan orsaka överdriven skada på celler. Strategier för att permeabilisera celler med termiska medel inkluderar (1) cykling av celler genom en kylnings-uppvärmningscykel, som kan eller inte kan innebära frysning, (2) uppvärmning av celler till suprafysiologiska temperaturer och (3) övergående intensiv uppvärmning av en liten del av cell. I det senare fallet termiska bläckstråleskrivare framgångsrikt använts för intracellulär leverans och transfektion i djurceller. Laser-partikelinteraktioner har rapporterats för att exakt termiskt störa cellmembran. Guldnanopartiklar packades i ett tätt ytskikt där >10 s av infraröd laserstrålning värmer upp undersidan av celler för att utlösa permeabilisering och leverans av färgämnen, dextraner och plasmider. År 2021 utvecklades detta koncept ytterligare när forskare visade att ljuskänsliga nanopartiklar av järnoxid inbäddade i biokompatibla elektrospunna nanofibrer kan utlösa membranpermeabilisering genom fototermiska effekter utan direkt kontakt mellan celler och nanopartiklar. Denna metod kunde leverera CRISPR-Cas9- maskiner och siRNA till adherenta och suspensionsceller, inklusive embryonala stamceller och svårtransfekterade T-celler .

Biokemisk förbättring av last och transportörer

mRNA-läkemedel . Framsteg inom formulering av lipidnanopartiklar och nukleinsyrakemi har varit avgörande i utvecklingen av nukleinsyraterapi, såsom mRNA-vacciner. Till exempel, design av katjoniska joniserbara lipider, som är en nyckelkomponent i lipidnanopartikelformuleringar, med en syradissociationskonstant (pKa) nära det tidiga endosomala pH-värdet möjliggör endosomal frisättning i cytoplasman efter endocytos. I Moderna covid-vaccinet består lipidnanopartiklar av joniserbar lipid SM-102 , kolesterol , 1,2-distearoyl-snglycero-3 fosfokolin (DSPC) och PEG 2000-DMG för att kapsla in mRNA. Pfizer /BioNTech covid-vaccinerna använder ALC-0315- lipid från Acuitas Therapeutics och formulerar den med kolesterol , DSPC och en PEG -lipid ( ALC-0159) tillsammans med mRNA. Efter intramuskulär injektion kommer nanopartiklarna in i cellerna, mRNA frisätts i cytoplasman och uttrycket av SARS-CoV2 spikprotein sker i patientceller.

siRNA läkemedel . patisiran , det första siRNA-baserade läkemedlet som fick regulatoriskt godkännande från FDA 2018, är baserat på lipidnanopartikelformuleringar som förpackar och levererar siRNA till levern för att tysta en onormal patogen form av transtyretingenen . Det terapeutiska siRNA:t är formulerat med 2 lipidhjälpämnen, DLin-MC3-DMA och PEG2000-C-DMG, i en lipidnanopartikel som infunderas intravenöst i patienten och riktar sig mot hepatocyter i levern. Dessutom förbättrar kemiskt modifierade nukleotider i siRNA-terapi kemisk stabilitet och effektivitet, hjälper till att rikta in sig på vissa celltyper och tjänar till att minska negativa immunologiska reaktioner. Olika ligander inklusive små molekyler , kolhydrater , aptamerer , peptider och antikroppar har kopplats kovalent till siRNA för att förbättra cellulärt upptag och rikta specifika celltyper. Till exempel GalNAc -siRNA-konjugat inte bara ett tillvägagångssätt för ligandbaserad cellinternalisering utan behov av katjoniska material, utan riktar sig också specifikt mot hepatocyter . GalNAc -siRNA-konjugat användes i det andra FDA-godkända siRNA-läkemedlet, Givosiran , som administreras för att behandla akut leverporfyri genom att nedreglera ALAS1 -uttrycket i levern.

ASO Mediciner . Den första godkända medicinen mot antisense oligonukleotider (ASO) presenterades 1998 med fomivirsen , en 21-mer oligonukleotid som blockerar översättningen av cytomegalovirus mRNA. Genom att binda pre-mRNA eller mRNA kan ASO:er post-transkriptionellt reglera proteinsyntes genom mekanismer inklusive modifiering av pre-mRNA-bearbetning och splitsning, kompetitiv hämning, sterisk blockad av translationsmaskineri och nedbrytning av bundet mål-RNA. Kemiska modifieringar av ASO-nukleosider, nukleobaser och internukleosidryggraden är nyckeln för att förbättra farmakokinetik och farmakodynamik samtidigt som målaffinitet och effektivitet bibehålls. Terapeutiskt effektiva ASO:er är kraftigt modifierade, så de kräver ingen bärare för intracellulär leverans. De flesta medicinskt tillämpbara ASO:er är nakna molekyler som kan komma in i celler genom endocytos och utöva sina terapeutiska effekter genom att binda sitt intracellulära mål.

Förbättrade virala vektorer . Nästan 70 % av de kliniska prövningarna av genterapi har använt virala vektorer för genleveranssteget. Adenovirus, Adeno-associerat virus (AAV) och lentivirala vektorer är för närvarande de viktigaste virala vektorerna som används i bioteknik och kliniska tillämpningar. AAV är ett framträdande exempel på förbättringar gjorda i virala vektorer. Vektorteknik kan öka AAV-transduktionseffektiviteten (genom att optimera transgenkassetten), vektortropism ( med kapsidteknik ) och kapsidens och transgenens förmåga att undvika värdens immunsvar (genom att genetiskt modifiera dessa komponenter), samt optimera de stora produktion i skala av AAV. Dessutom har vektortekniska tillvägagångssätt inklusive riktad evolution avsevärt förbättrat effektiviteten och målinriktningen av AAV-vektorer, vilket resulterar i >100-faldig förbättring av leveranseffektiviteten i vissa fall. I ett annat exempel på AAV-teknik maskininlärning använts för att generera AAV-varianter som kan kringgå immunsvar från tidigare exponering.

Virusliknande partiklar . Virusliknande partiklar (VLP) är sammansättningar av virala proteiner som förpackar lastmaterial såsom mRNA, proteiner eller RNP förutom, eller istället för, viralt genetiskt material. Eftersom VLPs härrör från befintliga virala byggnadsställningar, utnyttjar de naturliga egenskaper hos virus som möjliggör effektiv intracellulär leverans, inklusive deras förmåga att kapsla in laster, undkomma endosomer och omprogrammeras för att rikta in sig på olika celltyper. Men till skillnad från virus kan VLP:er leverera sin last som mRNA eller protein istället för som DNA, vilket avsevärt minskar riskerna för integrering av viral genom. VLP:er är därför av intresse för att leverera molekylär last såsom genredigeringsmedel eftersom de kan erbjuda fördelar med både viral och icke-viral leverans. Konstruerade DNA-fria VLP:er har nyligen visat sig effektivt paketera och leverera basredigerare eller Cas9 -ribonukleoproteiner till däggdjursceller i syfte att genredigera. Det rapporterades att leverans av genredigeringsproteiner med VLP:er erbjöd väsentligt minimerad redigering utanför målet jämfört med plasmid och viral leverans in vitro .

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Intracellular_delivery&oldid=1140097982 "