DNA-superspiral
DNA-supercoiling hänvisar till mängden snodd i en viss DNA- sträng, som bestämmer mängden påfrestning på den. En given sträng kan vara "positivt supercoiled" eller "negativt supercoiled" (mer eller mindre hårt lindad). Mängden av en strängs supercoiling påverkar ett antal biologiska processer, som att komprimera DNA och reglera tillgången till den genetiska koden (vilket starkt påverkar DNA-metabolismen och eventuellt genuttryck). Vissa enzymer, såsom topoisomeraser , ändrar mängden DNA-supercoiling för att underlätta funktioner som DNA-replikation och transkription . Mängden supercoiling i en given sträng beskrivs av en matematisk formel som jämför den med ett referenstillstånd som kallas "avslappnad B-form" DNA.
Översikt
I ett "avslappnat" dubbelspiralsegment av B-DNA vrider sig de två strängarna runt spiralaxeln en gång var 10,4–10,5 baspar av sekvensen . Att lägga till eller subtrahera vändningar, som vissa enzymer gör, medför påfrestningar. Om ett DNA-segment under vridning stängs till en cirkel genom att förena dess två ändar och sedan tillåts röra sig fritt, antar det en annan form, till exempel en åttasiffra. Denna form kallas en superspole . (Substantivformen "supercoil" används ofta när man beskriver DNA-topologi .)
DNA från de flesta organismer är vanligtvis negativt supercoiled. Det blir tillfälligt positivt supercoiled när det replikeras eller transkriberas. Dessa processer hämmas (regleras) om de inte omedelbart avslappnas. Den enklaste formen av en superspole är en åttasiffra; en cirkulär DNA-sträng antar denna form för att rymma fler eller få spiralformade vridningar. De två loberna i figuren åtta kommer att visas roterade antingen medurs eller moturs i förhållande till varandra, beroende på om helixen är över- eller underlindad. För varje ytterligare spiralvridning som tas emot, kommer loberna att visa ytterligare en rotation kring sin axel.
Lobala förvrängningar av ett cirkulärt DNA, såsom rotationen av de åtta loberna ovan, kallas writhe . Ovanstående exempel illustrerar att vridning och vridning är interkonvertibla. Supercoiling kan representeras matematiskt av summan av vridning och vridning. Vridningen är antalet spiralformade varv i DNA:t och vridningen är antalet gånger den dubbla helixen korsar sig själv (dessa är superspolarna). Extra spiralformade vridningar är positiva och leder till positiv supercoiling, medan subtraktiv vridning orsakar negativ supercoiling. Många topoisomerasenzymer känner av supercoiling och antingen genererar eller försvinner den när de ändrar DNA-topologi.
Delvis eftersom kromosomerna kan vara mycket stora, kan segment i mitten fungera som om deras ändar är förankrade. Som ett resultat kan de kanske inte fördela överflödig vridning till resten av kromosomen eller att absorbera vridning för att återhämta sig från underlindning - segmenten kan bli supercoiled , med andra ord. Som svar på supercoiling kommer de att anta en mängd vridning, precis som om deras ändar var sammanfogade.
Supercoiled DNA bildar två strukturer; ett plektonem eller en toroid , eller en kombination av båda. En negativt supercoiled DNA-molekyl kommer att producera antingen en enstarts vänsterhänt helix, toroid, eller en två-start högerhänt helix med terminala slingor, plektonemet. Plektonemer är vanligtvis vanligare i naturen, och detta är den form de flesta bakteriella plasmider kommer att ta. För större molekyler är det vanligt att hybridstrukturer bildas – en slinga på en toroid kan sträcka sig in i ett pektonem. Om alla slingor på en toroid sträcker sig blir det en förgreningspunkt i den pektonemiska strukturen. DNA-supercoiling är viktigt för DNA-paketering inom alla celler, och verkar också spela en roll i genuttryck.
Interkalationsinducerad supercoiling av DNA
Baserat på egenskaperna hos interkalerande molekyler, dvs fluorescerande vid bindning till DNA och avveckling av DNA-baspar, har 2016 en enkelmolekylteknik introducerats för att direkt visualisera individuella pektonem längs superspiral-DNA, vilket ytterligare skulle göra det möjligt att studera interaktioner mellan DNA-bearbetar proteiner med supercoiled DNA. I den studien användes Sytox Orange (ett interkalerande färgämne) för att inducera supercoiling på ytbundna DNA-molekyler.
Med användning av denna analys fann man att DNA-sekvensen kodar för positionen av pektonemiska superspolar. Vidare visade sig DNA-superspolar vara anrikade vid transkriptionsstartställena i prokaryoter .
Funktioner
Genomförpackning
DNA-supercoiling är viktigt för DNA-förpackning inom alla celler. Eftersom längden på DNA kan vara tusentals gånger större än en cell, är det en svår bedrift att packa in detta genetiska material i cellen eller kärnan (i eukaryoter ). Supercoiling av DNA minskar utrymmet och gör att DNA kan förpackas. Hos prokaryoter är plexonemic supercoils dominerande på grund av den cirkulära kromosomen och relativt liten mängd genetiskt material. I eukaryoter finns DNA-superspolar på många nivåer av både pektonemiska och solenoidala superspolar, där den solenoidala superspolningen visar sig vara mest effektiv för att komprimera DNA. Solenoidal supercoiling uppnås med histoner för att bilda en 10 nm fiber. Denna fiber lindas ytterligare till en 30 nm fiber och lindas ytterligare på sig själv många gånger mer.
DNA-förpackning ökar kraftigt under mitos när duplicerade syster-DNA:n segregeras till dotterceller. Det har visat sig att kondensin , ett stort proteinkomplex som spelar en central roll vid sammansättning av mitotiska kromosomer, inducerar positiva superspolar på ett ATP -hydrolysberoende sätt in vitro . Supercoiling kan också spela en viktig roll under interfas i bildandet och underhållet av topologiskt associerande domäner ( TADs).
Supercoiling krävs också för DNA/RNA-syntes . Eftersom DNA måste lindas upp för DNA/RNA- polymerasverkan , uppstår superspiraler. Regionen framför polymeraskomplexet kommer att avlindas; denna stress kompenseras med positiva superspolar före komplexet. Bakom komplexet lindas DNA tillbaka och det kommer att finnas kompenserande negativa superspolar. Topoisomeraser såsom DNA-gyras (Typ II Topoisomeras) spelar en roll för att lindra en del av stressen under DNA/RNA-syntes.
Genexpression
Specialiserade proteiner kan packa upp små segment av DNA-molekylen när den replikeras eller transkriberas till RNA . Men arbete som publicerades 2015 illustrerar hur DNA öppnar sig av sig själv.
Att helt enkelt vrida DNA kan exponera inre baser till utsidan, utan hjälp av några proteiner. Transkriptionen i sig förvränger också DNA i levande mänskliga celler, drar åt vissa delar av spolen och lossar den i andra. Den stressen utlöser förändringar i form, framför allt öppnar spiralen för att läsas. Tyvärr är dessa interaktioner mycket svåra att studera eftersom biologiska molekyler formar sig så lätt. År 2008 noterades det att transkription vrider DNA och lämnar ett spår av underspirat (eller negativt superspiralt) DNA i dess spår. Dessutom upptäckte de att själva DNA-sekvensen påverkar hur molekylen reagerar på supercoiling.
Till exempel identifierade forskarna en specifik DNA-sekvens som reglerar transkriptionshastigheten; när mängden superspiral stiger och sjunker saktar eller snabbar den upp hastigheten med vilken molekylärt maskineri läser DNA. Det antas att dessa strukturella förändringar kan utlösa stress någon annanstans längs dess längd, vilket i sin tur kan ge triggerpunkter för replikering eller genuttryck. Detta innebär att det är en mycket dynamisk process där både DNA och proteiner påverkar hur den andra agerar och reagerar.
Genuttryck under köldchock
Nästan hälften av generna från bakterien E. coli som undertrycks under köldchock förtrycks på liknande sätt när Gyrase blockeras av antibiotikan Novobiocin. Vidare, under kylchocker, ökar nukleoidernas densitet, och proteingyraset och nukleoiden blir kolokaliserade (vilket är förenligt med en minskning av DNA-avslappning). Detta är ett bevis på att minskningen av negativ supercoiling av DNA:t är en av huvudmekanismerna som är ansvariga för blockering av transkription av hälften av generna som leder det transkriptionella responsprogrammet för köldchock för bakterier. Utifrån detta har en stokastisk modell av denna process föreslagits. Denna modell illustreras i figuren, där reaktion 1 representerar transkription och dess låsning på grund av supercoiling. Under tiden modellerar reaktionerna 2 till 4 translation respektive RNA- och proteinnedbrytning.
Matematisk beskrivning
I naturen är cirkulärt DNA alltid isolerat som en högre ordning helix-på-en-helix, känd som en superhelix . I diskussioner om detta ämne hänvisas till Watson-Crick-vridningen som en "sekundär" lindning, och superhelices som en "tertiär" lindning. Skissen till höger indikerar en "avslappnad" eller "öppen cirkulär" Watson–Crick dubbelhelix, och bredvid den en högerhänt superhelix. Den "avslappnade" strukturen till vänster hittas inte om inte kromosomen är hackad; superhelixen är den form som vanligtvis finns i naturen.
För matematiska beräkningar definieras en högerhänt superhelix som att den har ett "negativt" antal superhelixvarv, och en vänsterhänt superhelix definieras som att den har ett "positivt" antal superheliska varv. På ritningen (visad till höger) är både sekundärlindningen ( dvs. "Watson–Crick") och tertiärlindningen ( dvs. "superhelical") högervända, därför är supertwistningarna negativa (–3 i detta exempel ).
Superhelicitet antas vara ett resultat av underlindning, vilket betyder att det finns en brist i antalet sekundära Watson-Crick-vridningar. En sådan kromosom kommer att ansträngas, precis som en makroskopisk metallfjäder ansträngs när den antingen lindas över eller avlindas. I DNA som sålunda är ansträngt kommer supertwists att dyka upp.
DNA-supercoiling kan beskrivas numeriskt genom förändringar i länktalet Lk . Länkningsnumret är den mest beskrivande egenskapen hos supercoiled DNA. Lk o , antalet varv i den relaxerade (B-typ) DNA-plasmiden/molekylen, bestäms genom att dividera de totala basparen av molekylen med det avslappnade bp /varvet som, beroende på referens, är 10,4; 10,5; 10.6.
Lk är antalet kors som en enskild tråd gör över den andra, ofta visualiserad som antalet Watson-Crick-vridningar som finns i en cirkulär kromosom i en (vanligtvis imaginär) plan projektion. Detta nummer är fysiskt "låst" i ögonblicket av kovalent stängning av kromosomen, och kan inte ändras utan strängbrott.
Topologin för DNA:t beskrivs av ekvationen nedan där länktalet är ekvivalent med summan av Tw , vilket är antalet vridningar eller varv av dubbelhelixen, och Wr , som är antalet spolar eller "vridningar. " Om det finns en sluten DNA-molekyl ändras inte summan av Tw och Wr , eller länktalet. Det kan dock förekomma kompletterande förändringar i Tw och Wr utan att ändra deras summa:
Tw , som kallas "twist", är antalet Watson-Crick-vridningar i kromosomen när den inte är tvungen att ligga i ett plan. Vi har redan sett att nativt DNA vanligtvis befinns vara superhelical. Om man går runt den superheliskt tvinnade kromosomen och räknar sekundära Watson-Crick-vridningar, kommer den siffran att skilja sig från det antal som räknas när kromosomen är tvungen att ligga platt. I allmänhet förväntas antalet sekundära vridningar i den ursprungliga, supertvinnade kromosomen vara det "normala" Watson-Crick-lindningstalet, vilket betyder en enda 10-baspars spiralvridning för varje 34 Å DNA-längd.
Wr , kallad "writhe", är antalet superheliska vridningar. Eftersom biologiskt cirkulärt DNA vanligtvis är underlindat Lk i allmänhet att vara mindre än Tw , vilket betyder att Wr typiskt är negativ.
Om DNA är underlindat kommer det att vara under spänning, precis som en metallfjäder spänns när den lindas upp kraftigt, och att uppkomsten av supertwists gör att kromosomen kan avlasta sin belastning genom att ta på sig negativa supertwists, som korrigerar den sekundära underlindningen i enlighet med topologiekvationen ovan.
Topologiekvationen visar att det finns ett ett-till-ett förhållande mellan förändringar i Tw och Wr . Till exempel, om en sekundär "Watson-Crick"-twist tas bort, måste en högerhänt supertwist ha tagits bort samtidigt (eller, om kromosomen är avslappnad, utan supertwist, måste en vänsterhänt supertwist läggas till).
Förändringen i länktalet, Δ Lk , är det faktiska antalet varv i plasmiden/molekylen, Lk , minus antalet varv i den avslappnade plasmiden/molekylen Lk o :
Om DNA:t är negativt supercoiled, . Den negativa superspiralen innebär att DNA:t är underlindat.
Ett standarduttryck oberoende av molekylstorleken är den "specifika länkskillnaden" eller "superhelixdensiteten" betecknad σ , som representerar antalet varv som lagts till eller tagits bort i förhållande till det totala antalet varv i den avslappnade molekylen/plasmiden, vilket indikerar nivån av supercoiling.
Gibbs fria energi associerad med lindningen ges av ekvationen nedan
Skillnaden i Gibbs fria energi mellan det superlindade cirkulära DNA:t och upprullat cirkulärt DNA med N > 2000 bp approximeras av:
eller, 16 cal/bp.
Eftersom det länkande antalet L för superspiral-DNA är antalet gånger de två strängarna är sammanflätade (och båda strängarna förblir kovalent intakta), kan L inte förändras. Referenstillståndet (eller parametern) L 0 för en cirkulär DNA-duplex är dess avslappnade tillstånd. I detta tillstånd är dess vridning W = 0. Eftersom L = T + W , i ett avslappnat tillstånd T = L . Således, om vi har en 400 bp avslappnad cirkulär DNA-duplex, L ~ 40 (förutsatt ~10 bp per varv i B-DNA). Sedan T ~ 40 .
- Positivt supercoiling:
- T = 0, W = 0, sedan L = 0
- T = +3, W = 0, sedan L = +3
- T = +2, W = +1, sedan L = +3
- Negativ supercoiling:
- T = 0, W = 0, sedan L = 0
- T = -3, W = 0, sedan L = -3
- T = -2, W = -1, sedan L = -3
Negativa superspolar gynnar lokal avveckling av DNA, vilket möjliggör processer som transkription , DNA-replikation och rekombination . Negativ supercoiling tros också gynna övergången mellan B-DNA och Z-DNA och moderera interaktionerna mellan DNA-bindande proteiner involverade i genreglering .
Stokastiska modeller
Vissa stokastiska modeller har föreslagits för att ta hänsyn till effekterna av positiv supercoiling-uppbyggnad (PSB) i genuttrycksdynamiken (t.ex. i bakteriell genuttryck), som skiljer sig i, till exempel, detaljnivån. I allmänhet ökar detaljerna när man lägger till processer som påverkas av och påverkar supercoiling. När detta tillägg sker ökar modellens komplexitet.
Till exempel, i två modeller av olika komplexitet föreslås. I den mest detaljerade modellerades händelserna på nukleotidnivå, medan händelserna i den andra modellerades på enbart promotorregionen och krävde således mycket färre händelser att redovisas för.
Exempel på stokastiska modeller som fokuserar på effekterna av PSB på en promotors aktivitet finns i: . I allmänhet inkluderar sådana modeller en promotor, Pro, som är regionen för DNA som kontrollerar transkription och, således, vars aktivitet/låsning påverkas av PSB. Även inkluderade är RNA-molekyler (produkten av transkription), RNA-polymeraser (RNAP) som kontrollerar transkription och Gyraser (G) som reglerar PSB. Slutligen måste det finnas ett sätt att kvantifiera PSB på DNA:t (dvs. promotorn) vid varje givet tillfälle. Detta kan göras genom att ha någon komponent i systemet som produceras över tiden (t.ex. under transkriptionshändelser) för att representera positiva superspolar, och som tas bort genom verkan av Gyraser. Mängden av denna komponent kan sedan ställas in för att påverka transkriptionshastigheten.
Effekter på sedimentationskoefficient
De topologiska egenskaperna hos cirkulärt DNA är komplexa. I standardtexter förklaras dessa egenskaper undantagslöst i termer av en spiralformad modell för DNA, men 2008 noterades att varje topoisomer, negativ eller positiv, antar en unik och förvånansvärt bred fördelning av tredimensionella konformationer.
När sedimentationskoefficienten, s , för cirkulärt DNA fastställs över ett stort pH- område , ses följande kurvor. Tre kurvor visas här, representerande tre arter av DNA. Från topp till botten är de: "Form IV" (grön), "Form I" (blå) och "Form II" (röd).
"Form I" (blå kurva) är den traditionella nomenklaturen som används för den naturliga formen av duplex cirkulärt DNA, som utvinns från virus och intracellulära plasmider. Form I är kovalent stängd, och eventuell plektonemisk lindning som kan förekomma låses därför in. Om ett eller flera hack införs i Form I, blir fri rotation av en sträng i förhållande till den andra möjlig, och Form II (röd kurva) är sedd.
Form IV (grön kurva) är produkten av alkalidenaturering av Form I. Dess struktur är okänd, förutom att den är ihållande duplex och extremt tät.
Mellan pH 7 och pH 11,5 är sedimentationskoefficienten s , för Form I, konstant. Sedan sjunker den, och vid ett pH strax under 12 når den ett minimum. Med ytterligare ökningar i pH s sedan till sitt tidigare värde. Det stannar dock inte där, utan fortsätter att öka obevekligt. Vid pH 13 har värdet på s stigit till nästan 50, två till tre gånger dess värde vid pH 7, vilket indikerar en extremt kompakt struktur.
Om pH sedan sänks återställs inte s- värdet. Istället ser man den övre, gröna kurvan. DNA:t, nu i det tillstånd som kallas Form IV, förblir extremt tätt, även om pH återställs till det ursprungliga fysiologiska intervallet. Som nämnts tidigare är strukturen av Form IV nästan helt okänd, och det finns ingen för närvarande accepterad förklaring till dess extraordinära täthet. Allt som är känt om den tertiära strukturen är att den är duplex, men inte har någon vätebindning mellan baser.
Dessa beteenden hos formerna I och IV anses bero på de speciella egenskaperna hos duplex-DNA som har stängts kovalent till en dubbelsträngad cirkel. Om den kovalenta integriteten störs av till och med ett enda hack i en av strängarna, upphör allt sådant topologiskt beteende, och man ser den nedre Form II-kurvan (A). För Form II har förändringar i pH mycket liten effekt på s . Dess fysikaliska egenskaper är i allmänhet identiska med linjärt DNA. Vid pH 13 separeras strängarna i Form II helt enkelt, precis som strängarna av linjärt DNA gör. De separerade enkelsträngarna har något olika s- värden, men visar inga signifikanta förändringar i s med ytterligare ökningar i pH.
En fullständig förklaring av dessa data ligger utanför ramen för denna artikel. Kort sagt, förändringarna i s kommer till på grund av förändringar i superhelicitet hos cirkulärt DNA. Dessa förändringar i superhelicitet illustreras schematiskt av fyra små ritningar som har lagts strategiskt över figuren ovan.
Kortfattat, förändringarna av s som ses i pH-titreringskurvan ovan anses allmänt bero på förändringar i den superheliska lindningen av DNA under förhållanden med ökande pH. Upp till pH 11,5 producerar den påstådda "underlindningen" en högerhänt ("negativ") supertwist. Men när pH-värdet ökar, och den sekundära spiralformade strukturen börjar denaturera och varva ner, "vill" kromosomen (om vi får tala antropomorfiskt) inte längre ha hela Watson-Crick-lindningen, utan snarare "vill", alltmer, vara "underlindad". Eftersom det finns mindre och mindre påfrestningar som ska avlastas genom superhelixlindning, försvinner därför superhelixarna progressivt när pH ökar. Vid ett pH strax under 12 har alla incitament för superhelicitet gått ut, och kromosomen kommer att visas som en avslappnad, öppen cirkel.
Vid fortfarande högre pH tenderar kromosomen, som nu denatureras på allvar, att varva ner helt, vilket den inte kan göra (eftersom L k är kovalent inlåst). Under dessa förhållanden har det som en gång behandlades som "underwinding" faktiskt nu blivit "overwinding". Återigen finns det påfrestningar, och återigen lindras den (åtminstone delvis) av superhelicitet, men den här gången i motsatt riktning ( dvs vänsterhänt eller "positiv"). Varje vänsterhänt tertiär supertwist tar bort en enda, nu oönskad högerhänt Watson-Crick sekundär twist.
Titreringen slutar vid pH 13, där Form IV visas.
Se även
Allmänna referenser
- Bloomfield, Victor A.; Crothers, Donald M.; Tinoco, Jr., Ignacio (2000). Nukleinsyror: strukturer, egenskaper och funktioner . Sausalito, Kalifornien: University Science Books. s. 446–453. ISBN 978-0935702491 .