Proteinproduktion
Proteinproduktion är den biotekniska processen att generera ett specifikt protein . Det uppnås vanligtvis genom manipulering av genuttryck i en organism så att det uttrycker stora mängder av en rekombinant gen . Detta inkluderar transkription av det rekombinanta DNA:t till budbärar- RNA ( mRNA ), translationen av mRNA till polypeptidkedjor , som slutligen viks till funktionella proteiner och kan riktas mot specifika subcellulära eller extracellulära platser.
Proteinproduktionssystem (även kända som uttryckssystem ) används inom biovetenskap , bioteknik och medicin . Molekylärbiologisk forskning använder många proteiner och enzymer, av vilka många kommer från uttryckssystem; speciellt DNA-polymeras för PCR , omvänt transkriptas för RNA-analys, restriktionsendonukleaser för kloning och för att göra proteiner som screenas i läkemedelsupptäckt som biologiska mål eller som potentiella läkemedel själva. Det finns också betydande tillämpningar för expressionssystem vid industriell fermentering , särskilt produktionen av bioläkemedel som humant insulin för att behandla diabetes och för att tillverka enzymer .
Proteinproduktionssystem
Vanligt använda proteinproduktionssystem inkluderar de som härrör från bakterier , jäst , baculovirus / insekt , däggdjursceller och på senare tid trådformiga svampar såsom Myceliophthora thermophila . När bioläkemedel tillverkas med ett av dessa system kommer processrelaterade föroreningar som kallas värdcellsproteiner också in i slutprodukten i spårmängder.
Cellbaserade system
De äldsta och mest använda expressionssystemen är cellbaserade och kan definieras som " kombinationen av en expressionsvektor , dess klonade DNA och värden för vektorn som tillhandahåller ett sammanhang för att tillåta främmande genfunktion i en värdcell, som är att producera proteiner på en hög nivå ". Överuttryck är en onormalt och överdrivet hög nivå av genuttryck som ger en uttalad genrelaterad fenotyp .
Det finns många sätt att introducera främmande DNA till en cell för uttryck, och många olika värdceller kan användas för uttryck - varje uttryckssystem har distinkta fördelar och skyldigheter. Expressionssystem refereras normalt till av värden och DNA-källan eller leveransmekanismen för det genetiska materialet. Till exempel är vanliga värdar bakterier (såsom E.coli , B. subtilis ), jäst (såsom S.cerevisiae ) eller eukaryota cellinjer . Vanliga DNA-källor och leveransmekanismer är virus (som baculovirus , retrovirus , adenovirus ), plasmider , artificiella kromosomer och bakteriofag (som lambda ). Det bästa uttryckssystemet beror på genen som är involverad, till exempel är Saccharomyces cerevisiae ofta att föredra för proteiner som kräver betydande posttranslationell modifiering . Insekts- eller däggdjurscellinjer används när människoliknande splitsning av mRNA krävs. Icke desto mindre har bakteriellt uttryck fördelen att enkelt producera stora mängder protein, vilket krävs för röntgenkristallografi eller kärnmagnetisk resonansexperiment för strukturbestämning.
Eftersom bakterier är prokaryoter , är de inte utrustade med det fullständiga enzymatiska maskineriet för att åstadkomma de nödvändiga post-translationella modifieringarna eller molekylvikningen. Följaktligen är eukaryota proteiner med flera domäner som uttrycks i bakterier ofta icke-funktionella. Många proteiner blir också olösliga som inklusionskroppar som är svåra att återvinna utan hårda denatureringsmedel och efterföljande besvärlig proteinåterveckning.
För att ta itu med dessa problem har uttryckssystem som använder flera eukaryota celler utvecklats för tillämpningar som kräver att proteinerna anpassas som i eller närmare eukaryota organismer: celler från växter (dvs. tobak), av insekter eller däggdjur (dvs nötkreatur) transfekteras med gener och odlas i suspension och även som vävnader eller hela organismer, för att producera helt vikta proteiner. Däggdjursexpressionssystem in vivo har dock lågt utbyte och andra begränsningar (tidskrävande, toxicitet för värdceller,...). För att kombinera det höga utbytet/produktiviteten och de skalbara proteinegenskaperna hos bakterier och jäst, och avancerade epigenetiska egenskaper hos växter, insekter och däggdjurssystem, utvecklas andra proteinproduktionssystem med encelliga eukaryoter (dvs icke-patogena Leishmania-celler ) .
Bakteriesystem
Escherichia coli
E. coli är en av de mest använda expressionsvärdarna, och DNA introduceras normalt i en plasmidexpressionsvektor . Teknikerna för överuttryck i E. coli är välutvecklade och fungerar genom att öka antalet kopior av genen eller öka bindningsstyrkan för promotorregionen så att det underlättar transkription.
Till exempel kan en DNA-sekvens för ett protein av intresse klonas eller subklonas in i en plasmid med högt kopietal innehållande lac -promotorn (ofta LacUV5 ), som sedan transformeras in i bakterien E. coli . Tillsats av IPTG (en laktosanalog ) aktiverar lac-promotorn och får bakterierna att uttrycka proteinet av intresse.
E. coli stam BL21 och BL21(DE3) är två stammar som vanligtvis används för proteinproduktion. Som medlemmar av B-linjen saknar de lon- och OmpT -proteaser, vilket skyddar de producerade proteinerna från nedbrytning. DE3-profagen som finns i BL21(DE3) tillhandahåller T7 RNA-polymeras (driven av LacUV5-promotorn), vilket gör att vektorer med T7-promotorn kan användas istället.
Corynebacterium
Icke-patogena arter av den grampositiva Corynebacterium används för kommersiell produktion av olika aminosyror. Arten C. glutamicum används i stor utsträckning för att producera glutamat och lysin , komponenter i mänsklig mat, djurfoder och farmaceutiska produkter.
Uttryck av funktionellt aktiv human epidermal tillväxtfaktor har gjorts i C. glutamicum , vilket visar en potential för produktion i industriell skala av humana proteiner. Uttryckta proteiner kan riktas mot utsöndring genom antingen den allmänna, sekretoriska vägen (Sec) eller tvillingarginintranslokationsvägen (Tat).
Till skillnad från gramnegativa bakterier saknar den grampositiva Corynebacterium lipopolysackarider som fungerar som antigena endotoxiner hos människor.
Pseudomonas fluorescens
De icke-patogena och gramnegativa bakterierna, Pseudomonas fluorescens , används för högnivåproduktion av rekombinanta proteiner; allmänt för utveckling av bioterapeutika och vacciner. P. fluorescens är en metaboliskt mångsidig organism som möjliggör screening med hög genomströmning och snabb utveckling av komplexa proteiner. P. fluorescens är mest välkänd för sin förmåga att snabbt och framgångsrikt producera höga titrar av aktivt, lösligt protein.
Eukaryota system
Jästsvampar
Expressionssystem som använder antingen S. cerevisiae eller Pichia pastoris tillåter stabil och varaktig produktion av proteiner som bearbetas på samma sätt som däggdjursceller, med högt utbyte, i kemiskt definierade media av proteiner.
Filamentösa svampar
Filamentösa svampar, särskilt Aspergillus och Trichoderma , men också på senare tid Myceliophthora thermophila C1 har utvecklats till uttrycksplattformar för screening och produktion av olika industriella enzymer . Expressionssystemet Cl uppvisar en morfologi med låg viskositet i nedsänkt kultur, vilket möjliggör användning av komplexa tillväxt- och produktionsmedier.
Baculovirus -infekterade celler
Baculovirus -infekterade insektsceller ( Sf9 , Sf21 , High Five- stammar) eller däggdjursceller ( HeLa , HEK 293 ) tillåter produktion av glykosylerade eller membranproteiner som inte kan produceras med hjälp av svamp- eller bakteriesystem. Det är användbart för produktion av proteiner i stora mängder. Gener uttrycks inte kontinuerligt eftersom infekterade värdceller så småningom lyserar och dör under varje infektionscykel.
Icke-lytiskt uttryck av insektsceller
Icke-lytisk insektscellexpression är ett alternativ till det lytiska baculovirusexpressionssystemet. I icke-lytiskt uttryck transfekteras vektorer övergående eller stabilt in i det kromosomala DNA:t hos insektsceller för efterföljande genuttryck. Detta följs av selektion och screening av rekombinanta kloner. Det icke-lytiska systemet har använts för att ge högre proteinutbyte och snabbare uttryck av rekombinanta gener jämfört med baculovirus-infekterade celluttryck. Cellinjer som används för detta system inkluderar: Sf9 , Sf21 från Spodoptera frugiperda- celler, Hi-5 från Trichoplusia ni- celler och Schneider 2-celler och Schneider 3-celler från Drosophila melanogaster- celler. Med detta system lyserar inte celler och flera odlingssätt kan användas. Dessutom är proteinproduktionskörningar reproducerbara. Detta system ger en homogen produkt. En nackdel med detta system är kravet på ett ytterligare screeningssteg för att välja livsdugliga kloner .
Excavata
Leishmania tarentolae (kan inte infektera däggdjur) expressionssystem tillåter stabil och varaktig produktion av proteiner med högt utbyte, i kemiskt definierade medier. Producerade proteiner uppvisar helt eukaryota post-translationella modifieringar, inklusive glykosylering och disulfidbindningsbildning. [ citat behövs ]
Däggdjurssystem
De vanligaste däggdjursexpressionssystemen är ovarieceller från kinesisk hamster (CHO) och humana embryonala njurceller (HEK).
- Kinesisk hamster äggstockscell
- Musmyelom lymfoblastoid (t.ex. NS0-cell )
- Helt mänskligt
- Mänskliga embryonala njurceller ( HEK-293 )
- Mänskliga embryonala retinala celler (Crucells Per.C6)
- Humana amniocytceller (Glycotope och CEVEC)
Cellfria system
Cellfri produktion av proteiner utförs in vitro med renat RNA-polymeras, ribosomer, tRNA och ribonukleotider. Dessa reagens kan produceras genom extraktion från celler eller från ett cellbaserat expressionssystem. På grund av de låga uttrycksnivåerna och de höga kostnaderna för cellfria system används cellbaserade system mer allmänt.
Se även
- Cellosaurus , en databas med cellinjer
- Genexpression
- Encelligt protein
- Proteinrening
- Precisionsjäsning
- Värdcellsprotein
- Lista över rekombinanta proteiner
Vidare läsning
- Higgins SJ, Hames BD (1999). Proteinuttryck: ett praktiskt tillvägagångssätt . Oxford University Press. ISBN 978-0-19-963623-5 .
- Baneyx, François (2004). Protein Expression Technologies: Aktuell status och framtida trender . Garland Science. ISBN 978-0-9545232-5-1 .
externa länkar
|
Biblioteksresurser om proteinproduktion |
| Grupper |  |
|
|---|---|---|
| Mikrobiologi | ||
| Rörelse | ||
| Ekologi | ||
| Växter | ||
| Marin | ||
| Människorelaterade | ||
| Tekniker | ||
| Övrig | ||
