Kryokonservering

Kryogeniskt konserverade prover tas bort från en dewar av flytande kväve

Kryokonservering eller kryokonservering är en process där biologiskt material - celler , vävnader eller organ - fryses för att bevara materialet under en längre tid. Vid låga temperaturer (vanligtvis −80 °C (−112 °F) eller −196 °C (−321 °F) med flytande kväve ) stoppas effektivt all cellmetabolism som kan orsaka skada på det biologiska materialet i fråga. Kryokonservering är ett effektivt sätt att transportera biologiska prover över långa avstånd, lagra prover under långa tidsperioder och skapa en provbank för användarna. Molekyler, kallade kryoskyddande medel (CPA), tillsätts för att minska den osmotiska chock och fysiska påfrestningar som celler utsätts för under frysningsprocessen. Vissa kryoskyddsmedel som används i forskning är inspirerade av växter och djur i naturen som har unik kyltolerans för att överleva hårda vintrar, inklusive: träd, skogsgrodor och tardigrader.

Naturlig kryokonservering

Tardigrades , mikroskopiska flercelliga organismer, kan överleva frysning genom att ersätta det mesta av deras inre vatten med ett socker som kallas trehalos , vilket förhindrar det från att kristallisera som annars skadar cellmembranen . Blandningar av lösta ämnen kan uppnå liknande effekter. Vissa lösta ämnen, inklusive salter, har nackdelen att de kan vara giftiga vid intensiva koncentrationer. Förutom vattenbjörnen kan skogsgrodor tolerera att deras blod och andra vävnader fryser. Urea ackumuleras i vävnader som förberedelse för övervintring, och leverglykogen omvandlas i stora mängder till glukos som svar på inre isbildning. Både urea och glukos fungerar som " kryoskyddsmedel " för att begränsa mängden is som bildas och för att minska osmotisk krympning av celler. Grodor kan överleva många frys-/tiningshändelser under vintern om inte mer än cirka 65 % av det totala kroppsvattnet fryser. Forskning som utforskar fenomenet "frysa grodor" har utförts främst av den kanadensiska forskaren, Dr Kenneth B. Storey . [ citat behövs ]

Frystolerans , där organismer överlever vintern genom att frysa fasta och upphöra med livsfunktioner, är känd hos ett fåtal ryggradsdjur: fem arter av grodor ( Rana sylvatica , Pseudacris triseriata , Hyla crucifer , Hyla versicolor , Hyla chrysoscelis ), en av salamanderna keyserlingii ), en av ormar ( Thamnophis sirtalis ) och tre av sköldpaddor ( Chrysemys picta , Terrapene carolina , Terrapene ornata ). Snäppsköldpaddor Chelydra serpentina och väggödlor Podarcis muralis överlever också nominell frysning men det har inte fastställts att det är adaptivt för övervintring. I fallet med Rana sylvatica är ett kryoperserveringsmedel vanlig glukos, som ökar i koncentration med cirka 19 mmol/L när grodorna kyls långsamt.

Historia

Se även: Cryonics § Historia
Rör med biologiska prover placeras i flytande kväve

En tidig teoretiker för kryokonservering var James Lovelock . 1953 föreslog han att skador på röda blodkroppar under frysning berodde på osmotisk stress, och att en ökning av saltkoncentrationen i en uttorkande cell kunde skada den. I mitten av 1950-talet experimenterade han med kryokonservering av gnagare och bestämde att hamstrar kunde frysas med 60 % av vattnet i hjärnan kristalliserat till is utan några negativa effekter; andra organ visade sig vara känsliga för skador.

Kryokonservering tillämpades på mänskliga material med början 1954 med tre graviditeter som ett resultat av insemination av tidigare frusna spermier. Hönssperma kryokonserverades 1957 av ett team av forskare i Storbritannien under ledning av Christopher Polge . Under 1963 visade Peter Mazur, vid Oak Ridge National Laboratory i USA, att dödlig intracellulär frysning kunde undvikas om kylningen var tillräckligt långsam för att tillåta tillräckligt med vatten att lämna cellen under progressiv frysning av den extracellulära vätskan. Den hastigheten skiljer sig mellan celler av olika storlek och vattenpermeabilitet: en typisk nedkylningshastighet runt 1 °C/minut är lämplig för många däggdjursceller efter behandling med kryoskyddsmedel som glycerol eller dimetylsulfoxid, men hastigheten är inte ett universellt optimum.

Den 22 april 1966 frystes den första människokroppen – fastän den hade balsamerats i två månader – genom att den placerades i flytande kväve och förvarades strax över fryspunkten. Den äldre kvinnan från Los Angeles, vars namn är okänt, tinades snart upp och begravdes av släktingar. Den första människokroppen som frystes ner med hopp om framtida väckelse var James Bedfords , några timmar efter hans cancerorsakade död 1967. Bedford är den enda cryonicspatient som frysts före 1974 som fortfarande finns bevarad idag.

Temperatur

Förvaring vid mycket låga temperaturer antas ge en obestämd livslängd för celler, även om den faktiska effektiva livslängden är ganska svår att bevisa. Forskare som experimenterade med torkade frön fann att det fanns en märkbar variation av försämring när prover hölls vid olika temperaturer - till och med extremt kalla temperaturer. Temperaturer som är lägre än glasövergångspunkten (Tg) för polyolens vattenlösningar, runt −136 °C (137 K; −213 °F), tycks accepteras som intervallet där den biologiska aktiviteten avtar mycket, och −196 ° C (77 K; −321 °F), kokpunkten för flytande kväve, är den föredragna temperaturen för förvaring av viktiga prover. Medan kylar , frysar och extra kalla frysar används för många föremål, krävs generellt ultrakylning av flytande kväve för framgångsrikt bevarande av de mer komplexa biologiska strukturerna för att praktiskt taget stoppa all biologisk aktivitet.

Risker

Fenomen som kan orsaka skador på celler under kryokonservering inträffar främst under frysningsstadiet och inkluderar lösningseffekter, extracellulär isbildning, uttorkning och intracellulär isbildning. Många av dessa effekter kan reduceras av kryoskyddsmedel. När det konserverade materialet har blivit fruset är det relativt säkert från ytterligare skador.

Lösningseffekter
När iskristaller växer i iskallt vatten utesluts lösta ämnen , vilket gör att de koncentreras i det återstående flytande vattnet. Höga koncentrationer av vissa lösta ämnen kan vara mycket skadliga.
Extracellulär isbildning
När vävnader kyls långsamt migrerar vatten ut ur cellerna och is bildas i det extracellulära utrymmet. För mycket extracellulär is kan orsaka mekanisk skada på cellmembranet på grund av krossning.
Uttorkning
Migration av vatten, vilket orsakar extracellulär isbildning, kan också orsaka cellulär uttorkning. De associerade påfrestningarna på cellen kan orsaka skada direkt.
Intracellulär isbildning
Medan vissa organismer och vävnader kan tolerera en del extracellulär is, är all märkbar intracellulär is nästan alltid dödlig för celler.

De viktigaste metoderna för att förebygga risker

De viktigaste teknikerna för att förhindra kryokonserveringsskador är en väletablerad kombination av kontrollerad hastighet och långsam frysning och en nyare snabbfrysningsprocess som kallas förglasning .

Långsam programmerbar frysning

En tank med flytande kväve, som används för att förse en kryogen frys (för förvaring av laboratorieprover vid en temperatur på cirka -150 °C eller -238 °F)

Kontrollerad hastighet och långsam frysning , även känd som långsam programmerbar frysning (SPF), är en teknik där celler kyls till cirka -196 °C under loppet av flera timmar.

Långsam programmerbar frysning utvecklades i början av 1970-talet och resulterade så småningom i den första födseln av mänskliga frysta embryon 1984. Sedan dess har maskiner som fryser biologiska prover med hjälp av programmerbara sekvenser, eller kontrollerade hastigheter, använts för människa, djur och cellbiologi – "frysa ner" ett prov för att bättre bevara det för eventuell upptining, innan det fryses eller kryokonserveras i flytande kväve. Sådana maskiner används för att frysa oocyter, hud, blodprodukter, embryon, spermier, stamceller och allmän vävnadskonservering på sjukhus, veterinärkliniker och forskningslaboratorier runt om i världen. Som ett exempel uppskattas antalet levande födslar från frysta embryon "långfrusna" till cirka 300 000 till 400 000 eller 20 % av de uppskattade 3 miljoner in vitro-fertilisering (IVF) födslar.

Dödlig intracellulär frysning kan undvikas om kylningen är tillräckligt långsam för att tillåta tillräckligt med vatten att lämna cellen under progressiv frysning av den extracellulära vätskan. För att minimera tillväxten av extracellulära iskristaller och omkristallisering biomaterial som alginater , polyvinylalkohol eller kitosan användas för att förhindra iskristalltillväxt tillsammans med traditionella småmolekylära kryoskyddsmedel. Den hastigheten skiljer sig mellan celler av olika storlek och vattenpermeabilitet : en typisk nedkylningshastighet på cirka 1 °C/minut är lämplig för många däggdjursceller efter behandling med kryoskyddsmedel som glycerol eller dimetylsulfoxid (DMSO), men hastigheten är inte en universell optimalt. Hastigheten på 1 °C/minut kan uppnås genom att använda enheter som en hastighetskontrollerad frys eller en bärbar frysbehållare på bänken.

Flera oberoende studier har gett bevis för att frysta embryon som lagras med hjälp av långsam frysningsteknik på vissa sätt kan vara "bättre" än färska vid IVF. Studierna indikerar att användning av frysta embryon och ägg snarare än färska embryon och ägg minskade risken för dödfödsel och för tidig förlossning, även om de exakta orsakerna fortfarande undersöks.

Förglasning

Vitrifiering är en snabbfrysningsprocess (ultrasnabb kylning) som hjälper till att förhindra bildandet av iskristaller och hjälper till att förhindra kryokonserveringsskador.

Forskarna Greg Fahy och William F. Rall hjälpte till att introducera förglasning till reproduktiv kryokonservering i mitten av 1980-talet. Från och med 2000 hävdar forskare att förglasning ger fördelarna med kryokonservering utan skada på grund av iskristallbildning. Situationen blev mer komplex med utvecklingen av vävnadsteknik eftersom både celler och biomaterial måste förbli isfria för att bevara hög cellviabilitet och funktioner, integritet hos konstruktioner och struktur hos biomaterial. Förglasning av vävnadskonstruerade konstruktioner rapporterades först av Lilia Kuleshova, som också var den första forskaren som uppnådde förglasning av oocyter , vilket resulterade i levande födsel 1999. För klinisk kryokonservering kräver förglasning vanligtvis tillsats av kryoskyddsmedel innan kylning. Kryoskyddsmedel är makromolekyler som tillsätts till frysmediet för att skydda celler från de skadliga effekterna av intracellulär iskristallbildning eller från lösningseffekterna under frysning och upptining. De tillåter en högre grad av cellöverlevnad under frysning, för att sänka fryspunkten, för att skydda cellmembranet från frysrelaterade skador. Kryoskyddsmedel har hög löslighet, låg toxicitet vid höga koncentrationer, låg molekylvikt och förmågan att interagera med vatten via vätebindning.

Istället för att kristallisera blir den sirapsliknande lösningen en amorf is - den förglasar . Snarare än en fasförändring från vätska till fast genom kristallisation, är det amorfa tillståndet som en "fast vätska", och omvandlingen sker över ett litet temperaturintervall som beskrivs som "glasövergångstemperaturen " .

Förglasning av vatten främjas av snabb kylning och kan uppnås utan kryoskyddsmedel genom en extremt snabb temperatursänkning (megakelvin per sekund). Den hastighet som krävs för att uppnå glasartad tillstånd i rent vatten ansågs vara omöjlig fram till 2005.

Två villkor som vanligtvis krävs för att tillåta förglasning är en ökning av viskositeten och en minskning av frystemperaturen. Många lösta ämnen gör båda, men större molekyler har i allmänhet en större effekt, särskilt på viskositeten. Snabb kylning främjar också förglasning.

För etablerade metoder för kryokonservering måste det lösta ämnet penetrera cellmembranet för att uppnå ökad viskositet och minska frystemperaturen inuti cellen. Socker tränger inte lätt genom membranet. De lösta ämnen som gör det, såsom DMSO, ett vanligt kryoskyddsmedel, är ofta giftiga i intensiv koncentration. En av de svåra kompromisserna med förglasande kryokonservering gäller att begränsa skadan som produceras av kryoskyddsmedlet självt på grund av kryoskyddsmedelstoxicitet. Blandningar av kryoskyddsmedel och användningen av isblockerare har gjort det möjligt för 21st Century Medicine att förglasa en kaninjure till -135 °C med sin egenutvecklade vitrifieringsblandning . Efter återuppvärmning transplanterades njuren framgångsrikt till en kanin, med fullständig funktionalitet och livsduglighet, som kunde upprätthålla kaninen på obestämd tid som den enda fungerande njuren. År 2000 FM-2030 den första personen som framgångsrikt förglasades postumt.

Persufflation

Blod kan ersättas med inerta ädelgaser och/eller metaboliskt vitala gaser som syre , så att organ kan svalna snabbare och mindre frostskyddsmedel behövs. Eftersom vävnadsområden är åtskilda av gas, ackumuleras inte små expansioner, vilket skyddar mot splittring. Ett litet företag, Arigos Biomedical, "har redan återhämtat grishjärtan från 120 minusgrader", även om definitionen av "återhämtad" inte är klar. Tryck på 60 atm kan bidra till att öka värmeväxlingshastigheterna. Gasformig syreperfusion/persufflation kan förbättra organkonservering i förhållande till statisk kylförvaring eller hypotermisk maskinperfusion, eftersom den lägre viskositeten hos gaser kan hjälpa till att nå fler regioner av konserverade organ och leverera mer syre per gram vävnad.

Frysbara vävnader

Generellt är kryokonservering lättare för tunna prover och suspenderade celler, eftersom dessa kan kylas snabbare och därför kräver mindre doser av toxiska kryoskyddsmedel. Därför är kryokonservering av mänskliga lever och hjärtan för lagring och transplantation fortfarande opraktisk.

Icke desto mindre tillåter lämpliga kombinationer av kryoskyddsmedel och regimer för kylning och sköljning under uppvärmning ofta framgångsrik kryokonservering av biologiska material, särskilt cellsuspensioner eller tunna vävnadsprover. Exempel inkluderar:

Embryon

Huvudartikel: Embryon kryokonservering

Kryokonservering för embryon används för embryonlagring, t.ex. när IVF har resulterat i fler embryon än vad som för närvarande behövs.

En graviditet och resulterande frisk födelse har rapporterats från ett embryo som lagrats i 27 år, efter framgångsrik graviditet av ett embryo från samma parti tre år tidigare. Många studier har utvärderat de barn som föds från frusna embryon, eller "frosties". Resultatet har varit jämnt positivt utan ökning av fosterskador eller utvecklingsavvikelser. En studie av mer än 11 ​​000 kryokonserverade mänskliga embryon visade ingen signifikant effekt av lagringstid på överlevnad efter upptining för IVF eller oocytdonationscykler, eller för embryon som frysts i pronukleära eller klyvningsstadier. Dessutom hade inte lagringstiden någon signifikant effekt på klinisk graviditet, missfall, implantation eller levande födelse, vare sig från IVF eller oocytdonationscykler. Snarare är oocyternas ålder, överlevnadsandel och antalet överförda embryon prediktorer för graviditetsutfallet.

Äggstocksvävnad

Huvudartikel: Kryokonservering av äggstocksvävnad

Kryokonservering av äggstocksvävnad är av intresse för kvinnor som vill bevara sin reproduktionsfunktion bortom den naturliga gränsen, eller vars reproduktionspotential är hotad av cancerterapi, till exempel vid hematologiska maligniteter eller bröstcancer. Proceduren är att ta en del av äggstocken och utföra långsam frysning innan den förvaras i flytande kväve medan terapin pågår. Vävnad kan sedan tinas och implanteras nära äggledaren, antingen ortotopisk (på den naturliga platsen) eller heterotopisk (på bukväggen), där den börjar producera nya ägg, vilket tillåter normal befruktning. Ovarievävnaden kan också transplanteras till möss som är immunsupprimerade ( SCID-möss ) för att undvika transplantatavstötning , och vävnad kan skördas senare när mogna folliklar har utvecklats.

Oocyter

Huvudartikel: Kryokonservering av oocyter

Kryokonservering av mänskliga oocyter är en ny teknik där en kvinnas ägg ( oocyter ) extraheras, fryses och lagras. Senare, när hon är redo att bli gravid, kan äggen tinas, befruktas och överföras till livmodern som embryon . Sedan 1999, när födelsen av det första barnet från ett embryo som härrörde från förglasade uppvärmda kvinnas ägg rapporterades av Kuleshova och medarbetare i tidskriften Human Reproduction, har detta koncept blivit erkänt och utbrett. Detta genombrott för att uppnå vitrifiering av en kvinnas oocyter gjorde ett viktigt framsteg i vår kunskap och praktik av IVF-processen, eftersom den kliniska graviditetsfrekvensen är fyra gånger högre efter oocytvitrifiering än efter långsam frysning. Oocytvitrifiering är avgörande för att bevara fertiliteten hos unga onkologiska patienter och för individer som genomgår IVF som av religiösa eller etiska skäl motsätter sig bruket att frysa embryon.

Sädesvätska

Huvudartikel: Kryokonservering av sperma

Sperma kan användas framgångsrikt nästan oändligt efter kryokonservering. Den längsta rapporterade framgångsrika lagringen är 22 år. Den kan användas för spermiedonation där mottagaren vill ha behandlingen vid en annan tid eller plats eller som ett sätt att bevara fertiliteten för män som genomgår vasektomi eller behandlingar som kan äventyra deras fertilitet, såsom kemoterapi , strålbehandling eller operation.

Testikelvävnad

Huvudartikel: Kryokonservering av testikelvävnad

Kryokonservering av omogen testikelvävnad är en metod under utveckling för att utnyttja reproduktion till unga pojkar som behöver ha gonadotoxisk behandling. Djurdata är lovande eftersom friska avkommor har erhållits efter transplantation av frusna testikelcellsuspensioner eller vävnadsbitar. Ingen av alternativen för fertilitetsåterställning från frusen vävnad, dvs cellsuspensionstransplantation, vävnadstransplantation och in vitro-mognad, har ännu visat sig vara effektiv och säker hos människor.

Mossa

Fyra olika ekotyper av Physcomitrella patens lagrade på International Moss Stock Center

Kryokonservering av hela mossaväxter , speciellt Physcomitrella patens , har utvecklats av Ralf Reski och medarbetare och utförs på International Moss Stock Center . Denna biobank samlar in, bevarar och distribuerar mossmutanter och mossekotyper .

Mesenkymala stromaceller (MSC)

MSC:er kan, när de transfunderas omedelbart inom några timmar efter upptining, visa nedsatt funktion eller visa minskad effektivitet vid behandling av sjukdomar jämfört med de MSC:er som befinner sig i log-fas av celltillväxt (färsk). Som ett resultat bör kryokonserverade MSC:er föras tillbaka till log-fasen av celltillväxt i in vitro -odling innan dessa administreras för kliniska prövningar eller experimentella terapier. Återodling av MSC:er kommer att hjälpa till att återhämta sig från den chock som cellerna får under frysning och upptining. Olika kliniska prövningar på MSC har misslyckats som använde kryokonserverade produkter omedelbart efter upptining jämfört med de kliniska prövningar som använde färska MSC.

Utsäde

Kryokonservering av växter börjar bli avgörande för dess biologiska mångfaldsvärde. Frön betraktas ofta som ett viktigt leveranssystem för genetisk information. Kryokonservering av motsträviga fröer är svårast på grund av intolerans mot låg temperatur och låg vattenhalt. Däremot kan växtvitrifieringslösning lösa problemet och hjälpa motsträviga fröer (Nymphaea caerulea) kryobevara.

Bevarande av mikrobiologiska kulturer

Bakterier och svampar kan förvaras kortvarigt (månader till ungefär ett år, beroende) i kyla, men celldelning och ämnesomsättning stoppas inte helt och är därför inte ett optimalt alternativ för långtidslagring (år) eller för att bevara kulturer genetiskt eller fenotypiskt, eftersom celldelningar kan leda till mutationer eller sub-odling kan orsaka fenotypiska förändringar. Ett föredraget alternativ, artberoende, är kryokonservering. Nematodmaskar är de enda flercelliga eukaryoterna som har visat sig överleva kryokonservering.

Svampar

Svampar, särskilt zygomyceter, ascomycetes och högre basidiomyceter, oavsett sporbildning, kan lagras i flytande kväve eller djupfrysas. Kryokonservering är en kännetecknande metod för svampar som inte sporulerar (annars kan andra konserveringsmetoder för sporer användas till lägre kostnad och lätthet), sporulerar men har ömtåliga sporer (stora eller frystorka känsliga), är patogena (farliga för att hålla metaboliskt aktiva) svamp) eller ska användas för genetiska bestånd (helst för att ha en identisk sammansättning som den ursprungliga fyndigheten). Som med många andra organismer används kryoskyddsmedel som DMSO eller glycerol (t.ex. trådsvampar 10 % glycerol eller jäst 20 % glycerol). Skillnader mellan att välja kryoskyddsmedel är art- (eller klass)beroende, men generellt sett är kryoskyddsmedel som penetrerar svampar som DMSO, glycerol eller polyetylenglykol mest effektiva (andra icke-penetrerande inkluderar sockerarter mannitol, sorbitol, dextran, etc.). Frys-tina upprepning rekommenderas inte eftersom det kan minska livskraften. Back-up djupfrysar eller lagringsplatser för flytande kväve rekommenderas. Flera protokoll för frysning sammanfattas nedan (var och en använder kryorör av polypropen med skruvlock):

Bakterie

Många vanliga odlingsbara laboratoriestammar är djupfrysta för att bevara genetiskt och fenotypiskt stabila, långsiktiga bestånd. Sub-odling och förlängda kylda prover kan leda till förlust av plasmid(er) eller mutationer. Vanliga slutliga glycerolprocenthalter är 15, 20 och 25. Från en färsk odlingsplatta väljs en enda koloni av intresse och flytande odling görs. Från den flytande kulturen blandas mediet direkt med en lika stor mängd glycerol; kolonin bör kontrolleras för eventuella defekter som mutationer. Alla antibiotika bör tvättas från kulturen före långtidsförvaring. Metoderna varierar, men blandningen kan göras försiktigt genom inversion eller snabbt genom virvel och kylning kan variera genom att antingen placera kryoröret direkt vid -50 till -95 °C, chockfrysa i flytande kväve eller gradvis kyla och sedan förvara vid -80 °C C eller kylare (flytande kväve eller flytande kväveånga). Återvinningen av bakterier kan också variera, nämligen om pärlor förvaras i röret kan de få pärlorna användas för att plåta eller så kan den frysta mälden skrapas med en ögla och sedan pläteras, men eftersom endast lite buljong behövs för hela röret ska aldrig tinas helt och upprepad frysning-upptining bör undvikas. 100 % återhämtning är inte möjlig oavsett metod.

Frystolerans hos djur

Maskar

De mikroskopiska jordlevande nematodspolmaskarna Panagrolaimus detritophagus och Plectus parvus är de enda eukaryota organismerna som hittills har visat sig vara livskraftiga efter långvarig kryokonservering. I det här fallet var bevarandet naturligt snarare än konstgjort, på grund av permafrost .

Ryggradsdjur

Flera djurarter, inklusive fiskar, amfibier och reptiler har visat sig tolerera frysning. Minst fyra arter av grodor ( Pseudacris crucifer , Hyla versicolor , Pseudacris triseriata , Lithobates sylvaticus ) och flera arter av sköldpaddor ( Terrapene carolina , kläckande Chrysemys picta ), ödlor och ormar är frystoleranta och har utvecklat frysanpassningar för att överleva. Medan vissa grodor övervintrar under jorden eller i vatten, sjunker kroppstemperaturen fortfarande till −5 till −7 °C, vilket gör att de fryser. Skoggrodan ( Lithobates sylvaticus ) tål upprepad frysning, under vilken cirka 65 % av dess extracellulära vätska omvandlas till is .

Se även

Vidare läsning

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cryopreservation&oldid=1140669504 "