Alkaliskt fosfatas

Alkaliskt fosfatas
1ALK.png
Banddiagram (regnbågsfärg, N-terminal = blå, C-terminal = röd) över den dimera strukturen av bakteriellt alkaliskt fosfatas.
Identifierare
EG nr. 3.1.3.1
CAS-nr. 9001-78-9
Databaser
IntEnz IntEnz-vy
BRENDA BRENDA inträde
ExPASy NiceZyme-vy
KEGG KEGG inträde
MetaCyc Metabolisk väg
PRIAM profil
PDB- strukturer RCSB PDB PDBe PDB summa
Genontologi AmiGO / QuickGO
Sök
PMC artiklar
PubMed artiklar
NCBI proteiner
Alkaliskt fosfatas
PDB 1alk EBI.jpg
Struktur av alkaliskt fosfatas.
Identifierare
Symbol Alk_fosfatas
Pfam PF00245
InterPro IPR001952
SMART SM00098
PROSITE PDOC00113
SCOP2 1alk / SCOPe / SUPFAM
Tillgängliga proteinstrukturer:
Pfam   strukturer / ECOD  
PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj
PDBsumma struktur sammanfattning
PDB , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,

Enzymet alkaliskt fosfatas (EC 3.1.3.1, alkaliskt fosfomonoesteras; fosfomonoesteras; glycerofosfatas; alkaliskt fosfohydrolas; alkaliskt fenylfosfatas; ortofosforsyra-monoester fosfohydrolas (alkaliskt systemfafosfatester) linjeoptimum) ) katalyserar följande reaktion:

en fosfatmonoester + H2O = en alkohol + fosfat

Alkaliskt fosfatas har den fysiologiska rollen som defosforylerande föreningar. Enzymet finns i en mängd organismer, prokaryoter och eukaryoter , med samma allmänna funktion men i olika strukturella former som är lämpliga för miljön de fungerar i. Alkaliskt fosfatas finns i det periplasmatiska utrymmet hos E. coli- bakterier. Detta enzym är värmestabilt och har sin maximala aktivitet vid högt pH. Hos människor finns det i många former beroende på dess ursprung i kroppen - det spelar en integrerad roll i metabolismen i levern och utvecklingen i skelettet. På grund av dess utbredda prevalens i dessa områden, används dess koncentration i blodomloppet av diagnostiker som en biomarkör för att hjälpa till att fastställa diagnoser som hepatit eller osteomalaci .

Nivån av alkaliskt fosfatas i blodet kontrolleras genom ALP-testet, som ofta är en del av rutinmässiga blodprov. Nivåerna av detta enzym i blodet beror på faktorer som ålder, kön eller blodgrupp. Blodnivåerna av alkaliskt fosfatas ökar också med två till fyra gånger under graviditeten. Detta är ett resultat av ytterligare alkaliskt fosfatas som produceras av moderkakan och levern. Dessutom kan onormala nivåer av alkaliskt fosfatas i blodet indikera problem relaterade till levern, gallblåsan eller benen. Njurtumörer och infektioner samt undernäring har också visat onormala nivåer av alkaliskt fosfatas i blodet. Alkaliska fosfatasnivåer i en cell kan mätas genom en process som kallas "The scoring method". Ett blodutstryk tas vanligtvis och färgas för att kategorisera varje leukocyt i specifika "leukocytalkaliska fosfatasindex". Denna markör är utformad för att skilja leukocyter och bestämma olika enzymaktivitet från varje provs omfattning av färgning.

Bakteriell

I gramnegativa bakterier , såsom Escherichia coli , är alkaliskt fosfatas lokaliserat i det periplasmatiska utrymmet , utanför det inre cellmembranet och inom peptidoglykandelen av cellväggen. Eftersom det periplasmatiska gapet är mer benäget för miljövariationer än den inre cellen, är alkaliskt fosfatas lämpligen resistent mot inaktivering, denaturering eller nedbrytning . Denna egenskap hos enzymet är ovanlig för många andra proteiner.

Den exakta strukturen och funktionen av isozymet i E. coli är enbart inriktad på att tillhandahålla en källa till oorganiskt fosfat när miljön saknar denna metabolit. De oorganiska fosfaterna binds sedan till bärarproteiner som levererar de oorganiska fosfaterna till ett specifikt transportsystem med hög affinitet, känt som det fosfatspecifika transportsystemet (Pst-systemet), som transporterar fosfat över det cytoplasmatiska membranet.

Medan det yttre membranet av E. coli innehåller poriner som är permeabla för fosforylerade föreningar, gör det inte det inre membranet. En fråga uppstår i hur man transporterar sådana föreningar över det inre membranet och in i cytosolen. Den starka anjoniska laddningen av fosfatgrupper tillsammans med resten av föreningen gör fosforylerade föreningar mycket oblandbara i det opolära området av dubbelskiktet. Lösningen uppstår vid klyvning av fosfatgruppen från föreningen via ALP. Defosforyleringsreaktionen som ALP katalyserar ger rent oorganiskt fosfat, som i slutändan kan målsättas av Pst-systemet för translokation till cytosolen, med åtföljande produktion av en defosforylerad förening. Som sådan är huvudsyftet med defosforylering med alkaliskt fosfatas att öka diffusionshastigheten av fosforylerade molekyler in i cellerna samtidigt som de hindrar dem från att diffundera ut.

Alkaliskt fosfatas är ett zinkhaltigt dimeriskt enzym med molekylvikten: 86 000 Da, varje subenhet innehåller 429 aminosyror med fyra cysteinrester som länkar de två subenheterna. Alkaliskt fosfatas innehåller fyra Zn-joner och två Mg-joner, där Zn upptar aktiva platser A och B, och Mg upptar plats C, så det fullt aktiva naturliga alkaliska fosfataset kallas (Zn A Zn B Mg C ) 2 enzym . Verkningsmekanismen för alkaliskt fosfatas involverar den geometriska koordinationen av substratet mellan Zn-jonerna i de aktiva platserna, medan Mg-stället inte verkar vara tillräckligt nära för att direkt delta i hydrolysmekanismen, men det kan bidra till formen på den elektrostatiska potentialen runt det aktiva centret.

Alkaliskt fosfatas i E. coli är ovanligt lösligt och aktivt under förhöjda temperaturer såsom 80 °C. På grund av den kinetiska energin som induceras av denna temperatur bryts de svaga vätebindningarna och hydrofoba interaktionerna av vanliga proteiner ned och sammansmälter och fälls därför ut. Vid dimerisering av alkaliskt fosfatas begravs emellertid bindningarna som bibehåller dess sekundära och tertiära strukturer effektivt så att de inte påverkas lika mycket vid denna temperatur. Vidare har alkaliskt fosfatas även vid mer förhöjda temperaturer, såsom 90°C, den ovanliga egenskapen omvänd denaturering. På grund av detta, även om det slutligen denatureras vid cirka 90 °C, har det den extra förmågan att korrekt reformera sina bindningar och återgå till sin ursprungliga struktur och funktion när den väl har kylts ner igen.

Alkaliskt fosfatas i E. coli finns i det periplasmatiska utrymmet och kan därmed frisättas med hjälp av tekniker som försvagar cellväggen och frisätter proteinet. På grund av enzymets placering och enzymets proteinlayout är enzymet i lösning med en mindre mängd proteiner än det finns i en annan del av cellen. Proteinernas värmestabilitet kan också utnyttjas vid isolering av detta enzym (genom värmedenaturering). Dessutom kan alkaliskt fosfatas analyseras med användning av p-nitrofenylfosfat. En reaktion där alkaliskt fosfatas defosforylerar det ospecifika substratet, p-Nitrofenylfosfat, för att producera p-Nitrofenol (PNP) och oorganiskt fosfat. PNP:s gula färg och dess λ max vid 410 tillåter spektrofotometri att bestämma viktig information om enzymatisk aktivitet. Vissa komplexiteter av bakteriell reglering och metabolism tyder på att andra, mer subtila, syften för enzymet också kan spela en roll för cellen. I laboratoriet överlever emellertid mutant Escherichia coli som saknar alkaliskt fosfatas ganska bra, liksom mutanter som inte kan stänga av produktionen av alkaliskt fosfatas.

Det optimala pH-värdet för aktiviteten av E. coli -enzymet är 8,0 medan det optimala pH-värdet för bovint enzym är något högre vid 8,5. Alkaliskt fosfatas står för 6% av alla proteiner i depressiva celler.

Intragent komplement

När flera kopior av en polypeptid som kodas av en gen bildar ett aggregat, hänvisas denna proteinstruktur till som en multimer. När en multimer bildas från polypeptider producerade av två olika mutanta alleler av en speciell gen, kan den blandade multimeren uppvisa större funktionell aktivitet än de oblandade multimererna som bildas av var och en av mutanterna ensam. I ett sådant fall kallas fenomenet för intragen komplementering . E. coli alkaliskt fosfatas, ett dimerenzym, uppvisar intragen komplementering. När speciella muterade versioner av alkaliskt fosfatas kombinerades, uppvisade de heterodimera enzymerna som bildades som ett resultat en högre aktivitetsnivå än vad som skulle förväntas baserat på de relativa aktiviteterna hos moderenzymerna. Dessa fynd indikerade att dimerstrukturen av E.coli alkaliskt fosfatas tillåter samverkande interaktioner mellan de ingående monomererna som kan generera en mer funktionell form av holoenzymet. [ citat behövs ]

Använd i forskning

Genom att ändra aminosyrorna i det vildtypiska alkaliska fosfatasenzymet som produceras av Escherichia coli, skapas ett muterat alkaliskt fosfatas som inte bara har en 36-faldig ökning av enzymaktivitet, utan också bibehåller termisk stabilitet. Typiska användningar i labbet för alkaliska fosfataser inkluderar borttagning av fosfatmonoestrar för att förhindra självligering, vilket är oönskat under plasmid-DNA-kloning .

Vanliga alkaliska fosfataser som används i forskning inkluderar:

  • Räkalkaliskt fosfatas (SAP), från en art av arktiska räkor ( Pandalus borealis ) . Detta fosfatas inaktiveras lätt av värme, en användbar funktion i vissa applikationer.
  • Kalvtarm alkaliskt fosfatas (CIP)
  • Placentalt alkaliskt fosfatas (PLAP) och dess C-terminalt trunkerade version som saknar de sista 24 aminosyrorna (som utgör den domän som är mål för GPI-membranförankring) - det utsöndrade alkaliska fosfataset (SEAP). Det uppvisar vissa egenskaper som värmestabilitet, substratspecificitet och motståndskraft mot kemisk inaktivering.
  • Humant-tarm alkaliskt fosfatas. Människokroppen har flera typer av alkaliskt fosfatas närvarande, vilka bestäms av minst tre genloci. Var och en av dessa tre loci kontrollerar olika typer av alkaliskt fosfatasisozym . Emellertid kan utvecklingen av detta enzym strikt regleras av andra faktorer såsom termostabilitet, elektrofores, hämning eller immunologi.

Humant-tarm-alkaliskt fosfatas uppvisar cirka 80 % homologi med det bovina tarminnzymet som håller deras delade evolutionära ursprung. Samma bovina enzym har mer än 70 % homologi med humant placentaenzym. Emellertid delar det humana intestinala enzymet och placentaenzymet endast 20 % homologi trots deras strukturella likheter.

Alkaliskt fosfatas har blivit ett användbart verktyg i molekylärbiologiska laboratorier, eftersom DNA normalt har fosfatgrupper på 5'- änden. Avlägsnande av dessa fosfater förhindrar DNA från att ligera (5'-änden fäster vid 3'- änden), och håller därigenom DNA-molekyler linjära tills nästa steg i processen för vilken de förbereds; avlägsnande av fosfatgrupperna tillåter också radiomärkning (ersättning med radioaktiva fosfatgrupper) för att mäta närvaron av det märkta DNA:t genom ytterligare steg i processen eller experimentet. För dessa ändamål är det alkaliska fosfataset från räkor det mest användbara, eftersom det är lättast att inaktivera när det väl har gjort sitt jobb. [ citat behövs ]

En annan viktig användning av alkaliskt fosfatas är som märkning för enzymimmunanalyser . [ citat behövs ]

Odifferentierade pluripotenta stamceller har förhöjda nivåer av alkaliskt fosfatas på cellmembranet , därför används alkalisk fosfatasfärgning för att detektera dessa celler och för att testa pluripotens (dvs embryonala stamceller eller embryonala karcinomceller ).

Det finns en positiv korrelation mellan nivåer av alkaliskt fosfatas i ben i serum och benbildning hos människor, även om dess användning som biomarkör i klinisk praxis inte rekommenderas.

Pågående forskning

Nuvarande forskare undersöker ökningen av tumörnekrosfaktor-α och dess direkta effekt på uttrycket av alkaliskt fosfatas i vaskulära glatta muskelceller samt hur alkaliskt fosfatas (AP) påverkar de inflammatoriska svaren och kan spela en direkt roll för att förhindra organ. skada.

  • Alkaliskt fosfatas (AP) påverkar de inflammatoriska svaren hos patienter med kronisk njursjukdom och är direkt associerad med erytropoesstimulerande medel resistent anemi.
  • Intestinalt alkaliskt fosfatas (IAP) och mekanismen det använder för att reglera pH och ATP-hydrolys i råttduodenum.
  • Testa effektiviteten av hämmaren och dess inverkan på IAP vid akut tarminflammation samt utforska de molekylära mekanismerna för IAP för att "förbättra intestinal permeabilitet."

Mejeriindustrin

Huvudartikel: Pastörisering § Verifiering

Alkaliskt fosfatas används ofta i mejeriindustrin som en indikator på framgångsrik pastörisering. Detta beror på att den mest värmestabila bakterien som finns i mjölk , Mycobacterium paratuberculosis , förstörs av temperaturer som är lägre än de som krävs för att denaturera enzymet. Därför är dess närvaro idealisk för att indikera misslyckad pastörisering.

Verifiering av pastörisering utförs vanligtvis genom att mäta fluorescensen hos en lösning som blir fluorescerande när den exponeras för aktivt alkaliskt fosfatas. Fluorimetrianalyser krävs av mjölkproducenter i Storbritannien för att bevisa att alkaliskt fosfatas har denaturerats, eftersom p-Nitrofenylfosfat-tester inte anses vara tillräckligt noggranna för att uppfylla hälsostandarder.

Alternativt kan färgförändringen av p -nitrofenylfosfat som substrat i en buffrad lösning (Aschaffenburg Mullen Test) användas. Obehandlad mjölk skulle vanligtvis ge en gul färg inom ett par minuter, medan korrekt pastöriserad mjölk inte bör visa någon förändring. Det finns undantag från detta, som i fallet med värmestabila alkaliska fosfataser som produceras av vissa bakterier, men dessa bakterier bör inte finnas i mjölk. [ citat behövs ]

Inhibitorer

Alla alkaliska fosfatasisoenzymer från däggdjur utom placenta (PALP och SEAP) hämmas av homoarginin , och på liknande sätt blockeras alla utom intestinala och placenta av levamisol . Fosfat är en annan hämmare som kompetitivt hämmar alkaliskt fosfatas.

Ett annat känt exempel på en alkalisk fosfatasinhibitor är [(4-nitrofenyl)metyl]fosfonsyra.

I metallförorenad jord hämmas alkaliskt fosfatas av Cd (kadmium). Dessutom ökar temperaturen inhiberingen av Cd på enzymaktiviteten, vilket visas i de ökande värdena på K m .

Mänsklig

Fysiologi

Hos människor finns alkaliskt fosfatas i alla vävnader i hela kroppen, men är särskilt koncentrerat i levern , gallgången , njurarna , benen , tarmslemhinnan och placentan . I serumet dominerar två typer av alkaliska fosfatasisozymer : skelett och lever. Under barndomen är majoriteten av alkaliskt fosfatas av skelettursprung. Människor och de flesta andra däggdjur innehåller följande alkaliska fosfatasisozymer: [ citat behövs ]

  • ALPI – tarm (molekylmassa på 150 kDa)
  • ALPL – vävnadsspecifik (uttrycks huvudsakligen i lever, ben och njure)
  • ALPP – placenta (Regan isozym)
  • ALPG – könscell

Fyra gener kodar för de fyra isozymerna. Genen för vävnadsspecifikt alkaliskt fosfatas finns på kromosom 1 , och generna för de andra tre isoformerna finns på kromosom 2 .

Intestinalt alkaliskt fosfatas

Intestinalt alkaliskt fosfatas utsöndras av enterocyter och tycks spela en avgörande roll i tarmhomeostas och skydd samt för att undertrycka inflammation via undertryckande av den nedströms Toll-like receptor ( TLR)-4 -beroende och MyD88 -beroende inflammatoriska kaskaden. Det defosforylerar toxiska/inflammatoriska mikrobiella ligander som lipopolysackarider (LPS), ometylerade cytosin-guanindinukleotider, flagellin och extracellulära nukleotider som uridindifosfat eller ATP. Defosforylering av LPS genom IAP kan minska svårighetsgraden av Salmonella tryphimurium och Clostridioides difficile -infektion och återställa normal tarmmikrobiota. Således har förändrat IAP-uttryck varit inblandat i kroniska inflammatoriska sjukdomar såsom inflammatorisk tarmsjukdom (IBD). Det tycks också reglera lipidabsorption och bikarbonatsekretion i duodenalslemhinnan, vilket reglerar ytans pH. Sedan 1960 - talet har alkaliskt fosfatas i tarmen använts vid läkemedelstillförsel . Eftersom det klyver fosfatsubstrukturer från läkemedel, hjälpämnen och till och med från ytan av nanobärare, möjliggör detta enzym design av läkemedelsleveranssystem som kan ändra deras egenskaper i kroppen vid behov. Lösligheten för många läkemedel kan förbättras avsevärt genom utformningen av fosfatprodrugs . På tarmslemhinnan spjälkas fosfatsubstrukturerna av alkaliskt fosfatas och läkemedlet absorberas . Dessutom kan anjoniska nanobärare som uppvisar bioinerta egenskaper ändra sin yta till interaktiv när de har nått tarmepitelet eftersom en alkalisk fosfatasutlöst klyvning av anjoniska fosfatgrupper från deras ytladdning omvandlas till katjonisk förbättring, till exempel cellulärt upptag.

I cancerceller

Studier visar att det alkaliska fosfatasproteinet som finns i cancerceller liknar det som finns i icke-maligna kroppsvävnader och att proteinet härstammar från samma gen i båda. En studie jämförde enzymerna från levermetastaser från jättecellslungkarcinom och icke-maligna placentaceller. De två var lika i NH2 - terminalsekvens, peptidkarta, subenhets molekylvikt och isoelektronisk punkt.

I en annan studie där forskare undersökte närvaron av alkaliskt fosfatasprotein i en human koloncancercellinje, även känd som HT-29, visade resultaten att enzymaktiviteten liknade den hos den icke-maligna tarmtypen. Denna studie avslöjade dock att utan inverkan av natriumbutyrat är alkalisk fosfatasaktivitet ganska låg i cancerceller. En studie baserad på natriumbutyrateffekter på cancerceller visar att det har en effekt på androgenreceptorns co-regulator expression, transkriptionsaktivitet och även på histonacetylering i cancerceller. Detta förklarar varför tillsatsen av natriumbutyrat visar ökad aktivitet av alkaliskt fosfatas i cancercellerna i den mänskliga tjocktarmen. Dessutom stöder detta ytterligare teorin att alkaliskt fosfatasenzymaktivitet faktiskt är närvarande i cancerceller. [ citat behövs ]

I en annan studie odlades koriokarcinomceller i närvaro av 5-brom-2'-deoxiuridin och resultaten gav en 30- till 40-faldig ökning av alkaliskt fosfatasaktivitet. Denna procedur för att förbättra enzymets aktivitet kallas enzyminduktion . Bevisen visar att det faktiskt finns aktivitet av alkaliskt fosfatas i tumörceller, men den är minimal och behöver förbättras. Resultat från denna studie indikerar vidare att aktiviteterna för detta enzym varierar mellan de olika koriokarcinomcellinjerna och att aktiviteten hos det alkaliska fosfatasproteinet i dessa celler är lägre än i de icke-maligna placentacellerna. men nivåerna är betydligt högre hos barn och gravida kvinnor. Blodprover ska alltid tolkas med hjälp av referensintervallet från det laboratorium som utförde testet. Höga nivåer av alkaliskt fosfatas kan uppstå om gallgångarna är blockerade.

Nivån av alkaliskt fosfatas ökar också om det sker en aktiv benbildning, eftersom enzymet är en biprodukt av osteoblastaktivitet (som fallet vid Pagets bensjukdom ). [ citat behövs ]

Nivån av alkaliskt fosfatas är mycket mer förhöjd i metastaserande prostatacancerceller än icke-metastaserande prostatacancerceller. Höga nivåer av ALP hos patienter med prostatacancer är förknippad med en signifikant minskning av överlevnaden.

Nivåerna är också förhöjda hos personer med obehandlad celiaki . Sänkta nivåer av nivån av alkaliskt fosfatas är mindre vanliga än förhöjda nivåer. Källan till förhöjda nivåer kan härledas genom att erhålla serumnivåer av y-glutamyltransferas . Samtidig ökning av alkaliskt fosfatas och γ-glutamyltransferas bör ge upphov till misstanke om lever- och gallsjukdom.

Vissa sjukdomar påverkar inte nivåerna av alkaliskt fosfatas, till exempel hepatit C. En hög nivå av detta enzym återspeglar inte några skador i levern, även om höga nivåer av alkaliskt fosfatas kan bero på blockering av flödet i gallvägarna eller en ökning av trycket i levern.

Förhöjda nivåer

Huvudartikel: Förhöjt alkaliskt fosfatas

Om det är oklart varför nivån av alkaliskt fosfatas är förhöjd, kan isoenzymstudier med hjälp av elektrofores bekräfta källan till ökningen. Skelfosfatas (som är lokaliserat i osteoblaster och extracellulära lager av nysyntetiserad matris) släpps ut i cirkulationen genom en ännu oklar mekanism. Placentalt alkaliskt fosfatas är förhöjt i seminom och aktiva former av rakitis , såväl som i följande sjukdomar och tillstånd:

Sänkta nivåer

Följande tillstånd eller sjukdomar kan leda till minskade nivåer av alkaliskt fosfatas:

Prognostiska användningsområden

Mätning av alkaliskt fosfatas (tillsammans med prostataspecifikt antigen) under och efter sex månader av hormonbehandlad metastaserad prostatacancer visade sig förutsäga patienters överlevnad.

Leukocyt alkaliskt fosfatas

Leukocyt alkaliskt fosfatas finns i mogna vita blodkroppar . Nivåer av vita blodkroppar av LAP kan hjälpa till vid diagnosen av vissa tillstånd. [ citat behövs ]

Struktur och egenskaper

Alkaliskt fosfatas är homodimert enzym, vilket betyder att det bildas med två molekyler. Tre metalljoner, två Zn och en Mg, finns i de katalytiska platserna, och båda typerna är avgörande för att enzymatisk aktivitet ska uppstå. Enzymerna katalyserar hydrolysen av monoestrar i fosforsyra som dessutom kan katalysera en transfosforyleringsreaktion med stora koncentrationer av fosfatacceptorer. Medan huvuddragen i den katalytiska mekanismen och aktiviteten bevaras mellan alkaliskt fosfat från däggdjur och bakterier, har alkaliskt fosfatas från däggdjur en högre specifik aktivitet och K m -värden, alltså en lägre affinitet, mer alkaliskt pH-optimum, lägre värmestabilitet och är typiskt membranbundna. och hämmas av l-aminosyror och peptider via ett sätt av icke-konkurrenskraftig mekanism. Dessa egenskaper skiljer sig märkbart mellan olika alkaliska fosfatasisozymer från däggdjur och visar därför upp en skillnad i in vivo- funktioner. [ citat behövs ]

Alkaliskt fosfatas har homologi i ett stort antal andra enzymer och utgör en del av en superfamilj av enzymer med flera överlappande katalytiska aspekter och substrategenskaper. Detta förklarar varför de mest framträdande strukturella egenskaperna hos alkaliska däggdjur är som de är och refererar till deras substratspecificitet och homologi till andra medlemmar av nukleosidpyrofosfatas/fosfodiesterasfamiljen av isozym. Forskning har visat ett samband mellan medlemmar av familjen alkaliska fosfataser med arylsulfataser. Likheterna i struktur indikerar att dessa två enzymfamiljer kom från en gemensam förfader. Ytterligare analys har kopplat alkaliska fosfater och arylsulfataser till en större superfamilj. Några av de vanliga generna som finns i denna superfamilj är sådana som kodar för fosfodiesteraser såväl som autotoxin.

Se även

Vidare läsning

externa länkar

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Alkaline_phosphatase&oldid=1140496810 "