Restriktionsmodifieringssystem

Restriktionsmodifieringssystemet ( RM-systemet ) finns i bakterier och andra prokaryota organismer och ger ett försvar mot främmande DNA , såsom det som bärs av bakteriofager .

Bakterier har restriktionsenzymer , även kallade restriktionsendonukleaser , som klyver dubbelsträngat DNA vid specifika punkter till fragment, som sedan bryts ned ytterligare av andra endonukleaser. Detta förhindrar infektion genom att effektivt förstöra det främmande DNA som introduceras av ett smittämne (som en bakteriofag ). Ungefär en fjärdedel av de kända bakterierna har RM-system och av dem har ungefär hälften mer än en typ av system.

Eftersom sekvenserna som känns igen av restriktionsenzymerna är mycket korta, kommer bakterien själv nästan säkert att innehålla några i sitt genom. För att förhindra förstörelse av sitt eget DNA av restriktionsenzymerna tillsätts metylgrupper . Dessa modifieringar får inte störa DNA-basparet, och därför modifieras vanligtvis endast ett fåtal specifika baser på varje sträng.

Endonukleaser klyver interna/icke-terminala fosfodiesterbindningar. De gör det först efter att ha känt igen specifika sekvenser i DNA som vanligtvis är 4-6 baspar långa och ofta palindromiska .

Historia

RM-systemet upptäcktes först av Salvatore Luria och Mary Human 1952 och 1953. De fann att bakteriofag som växer inom en infekterad bakterie kunde modifieras så att bakteriofagens tillväxt begränsas (hämmas vid frisättning och återinfektion av en besläktad bakterie) ) (beskrivs även av Luria i hans självbiografi på sidorna 45 och 99 1984). 1953 Jean Weigle och Giuseppe Bertani liknande exempel på värdkontrollerad modifiering med användning av olika bakteriofagsystem. Senare arbete av Daisy Roulland-Dussoix och Werner Arber 1962 och många andra efterföljande arbetare ledde till förståelsen att begränsningen berodde på attack och nedbrytning av den modifierade bakteriofagens DNA av specifika enzymer från mottagarbakterierna. Ytterligare arbete av Hamilton O. Smith isolerade HindIi, den första i klassen av enzymer som nu kallas restriktionsenzymer , medan Daniel Nathans visade att den kan användas för restriktionskartläggning . När dessa enzymer isolerades i laboratoriet kunde de användas för kontrollerad manipulation av DNA, vilket gav grunden för utvecklingen av genteknik . Werner Arber, Daniel Nathans och Hamilton Smith tilldelades Nobelpriset i fysiologi eller medicin 1978 för sitt arbete med restriktionsmodifiering.

Typer

Det finns fyra kategorier av restriktionsmodifieringssystem: typ I, typ II, typ III och typ IV, alla med restriktionsenzymaktivitet och en metylasaktivitet (förutom typ IV som inte har någon metylasaktivitet). De namngavs i upptäcktsordningen, även om typ II-systemet är det vanligaste.

Typ I-system är de mest komplexa och består av tre polypeptider: R (restriktion), M (modifiering) och S (specificitet). Det resulterande komplexet kan både klyva och metylera DNA. Båda reaktionerna kräver ATP, och klyvning sker ofta ett avsevärt avstånd från igenkänningsstället. S-subenheten bestämmer specificiteten för både restriktion och metylering. Klyvning sker på varierande avstånd från igenkänningssekvensen, så diskreta band är inte lätta att visualisera med gelelektrofores .

Typ II-system är de enklaste och vanligaste. Istället för att fungera som ett komplex kodas metyltransferaset och endonukleaset som två separata proteiner och verkar oberoende (det finns inget specificitetsprotein). Båda proteinerna känner igen samma igenkänningsställe och konkurrerar därför om aktivitet. Metyltransferaset fungerar som en monomer och metylerar duplexet en sträng i taget. Endonukleaset fungerar som en homodimer , vilket underlättar klyvningen av båda strängarna. Klyvning sker vid en definierad position nära eller inom igenkänningssekvensen, vilket sålunda producerar diskreta fragment under gelelektrofores. Av denna anledning används typ II-system i laboratorier för DNA-analys och genkloning .

Typ III-system har R (res) och M (mod) proteiner som bildar ett komplex av modifiering och klyvning. M-proteinet kan dock metylera på egen hand. Metylering sker också bara på en sträng av DNA:t till skillnad från de flesta andra kända mekanismer. Heterodimeren som bildas av R- och M-proteinerna konkurrerar med sig själv genom att modifiera och begränsa samma reaktion . Detta resulterar i ofullständig matsmältning.

Typ IV-system är inte riktiga RM-system eftersom de bara innehåller ett restriktionsenzym och inte ett metylas. Till skillnad från de andra typerna, känner typ IV restriktionsenzymer igen och skär endast modifierat DNA.

Fungera

Neisseria meningitidis har flera restriktionsendonukleassystem av typ II som används i naturlig genetisk transformation . Naturlig genetisk transformation är en process genom vilken en mottagande bakteriecell kan ta upp DNA från en intilliggande donatorbakteriecell och integrera detta DNA i sitt genom genom rekombination. Även om tidigt arbete med restriktionsmodifieringssystem fokuserade på fördelen för bakterier av att skydda sig mot invaderande bakteriofag-DNA eller annat främmande DNA, är det nu känt att dessa system också kan användas för att begränsa DNA som introduceras genom naturlig transformation från andra medlemmar av samma, eller besläktade arter.

Hos den patogena bakterien Neisseria meningitidis (meningokocker) är kompetens för transformation en högt utvecklad och komplex process där flera proteiner på bakterieytan, i membranen och i cytoplasman interagerar med det inkommande transformerande DNA:t. Restriktionsmodifieringssystem är rikligt förekommande i släktet Neisseria . N. meningitidis har flera restriktionsendonukleassystem av typ II. Restriktionsmodifieringssystemen i N. meningitidis varierar i specificitet mellan olika klader. Denna specificitet ger en effektiv barriär mot DNA-utbyte mellan kladerna. Luria, på sidan 99 i sin självbiografi, hänvisade till ett sådant begränsningsbeteende som "ett extremt fall av ovänlighet." Restriktionsmodifiering verkar vara en viktig drivkraft för sexuell isolering och artbildning hos meningokocker. Caugant och Maiden föreslog att restriktionsmodifieringssystem i meningokocker kan verka för att möjliggöra genetiskt utbyte mellan mycket nära släktingar samtidigt som det minskar (men inte helt förhindrar) genetiskt utbyte mellan meningokocker som tillhör olika klonala komplex och besläktade arter.

RM-system kan också fungera som själviska genetiska element , vilket tvingar deras underhåll på cellen genom postsegregationell celldöd.

Vissa virus har utvecklat sätt att undergräva restriktionsmodifieringssystemet, vanligtvis genom att modifiera sitt eget DNA, genom att lägga till metyl- eller glykosylgrupper till det och på så sätt blockera restriktionsenzymerna. Andra virus, såsom bakteriofager T3 och T7, kodar för proteiner som hämmar restriktionsenzymerna.

För att motverka dessa virus har vissa bakterier utvecklat restriktionssystem som bara känner igen och klyver modifierat DNA, men som inte verkar på värdens omodifierade DNA. Vissa prokaryoter har utvecklat flera typer av restriktionsmodifieringssystem.

RM-system är mer rikligt förekommande i promiskuösa arter, där de etablerar preferentiella vägar för genetiskt utbyte inom och mellan linjer med besläktade RM-system. Eftersom repertoaren och/eller specificiteten hos RM-system i bakterielinjer varierar snabbt, förväntas de föredragna flödena av genetisk överföring inom arter ständigt förändras, vilket ger tidsberoende nätverk av genöverföring.

Ansökningar

Molekylärbiologi

(a) Kloning: RM-system kan klonas in i plasmider och selekteras på grund av resistensen som tillhandahålls av metyleringsenzymet. När plasmiden börjar replikera kommer metyleringsenzymet att produceras och metylera plasmid-DNA:t, vilket skyddar det från ett specifikt restriktionsenzym.

(b) Restriktionsfragmentlängdpolymorfismer: Restriktionsenzymer används också för att analysera DNA-sammansättningen med avseende på närvaro eller frånvaro av mutationer som påverkar REas-klyvningsspecificiteten. När vildtyp och mutanter analyseras genom digestion med olika REaser, varierar de gelelektroforetiska produkterna i längd, till stor del eftersom mutantgener inte kommer att klyvas i ett liknande mönster som vildtyp för närvaro av mutationer som gör REaserna ospecifika till mutantsekvensen.

Genterapi

Bakterie-RM-systemet har föreslagits som en modell för att utveckla humana antivirala gen- eller genomiska vacciner och terapier eftersom RM-systemet tjänar en medfödd försvarsroll i bakterier genom att begränsa tropism av bakteriofager. Forskningen är på REaser och ZFN som kan klyva DNA från olika mänskliga virus, inklusive HSV-2 , högrisk HPV och HIV-1 , med det slutliga målet att inducera målmutagenes och avvikelser hos humaninfekterande virus. Det mänskliga genomet innehåller redan rester av retrovirala genom som har inaktiverats och utnyttjats för egen vinning. I själva verket verkar mekanismerna för att tysta aktiva L1-genomiska retroelement av de tre primära reparationsexonukleas 1 (TREX1) och excision reparation korskomplementerande 1 (ERCC) efterlikna verkan av RM-system i bakterier, och den icke-homologa ändkopplingen ( NHEJ) som följer användningen av ZFN utan reparationsmall.

Ett stort framsteg är skapandet av artificiella restriktionsenzymer skapade genom att länka FokI-DNA-klyvningsdomänen med en rad DNA-bindande proteiner eller zinkfingermatriser, nu betecknade som zinkfingernukleaser (ZFN). ZFNs är ett kraftfullt verktyg för värdgenomredigering på grund av deras förbättrade sekvensspecificitet. ZFN arbetar i par, deras dimerisering förmedlas in-situ genom FoKI-domänen. Varje zinkfingerarray (ZFA) kan känna igen 9-12 baspar, vilket ger 18-24 för paret. En 5-7 bp spacer mellan klyvningsställena förstärker ZFNs specificitet ytterligare, vilket gör dem till ett säkert och mer exakt verktyg som kan appliceras på människor. En nyligen genomförd klinisk fas I-studie av ZFN för riktat avskaffande av CCR5-koreceptorn för HIV-1 har genomförts.

Deras relation med mobila genetiska element (MGE)

RM-system är viktiga aktörer i den samevolutionära interaktionen mellan mobila genetiska element (MGE) och deras värdar. Gener som kodar för RM-system har rapporterats röra sig mellan prokaryota genom inom MGE såsom plasmider, profager, insättningssekvenser/transposoner, integrativa konjugativa element (ICE) och integroner. Emellertid upptäcktes det nyligen att det finns relativt få RM-system i plasmider, några i profager och praktiskt taget inga i fager. Å andra sidan kodar alla dessa MGE för ett stort antal ensamma RM-gener, särskilt MTaser. Mot bakgrund av detta är det troligt att RM-mobilitet kan vara mindre beroende av MGE och mer beroende, till exempel, på förekomsten av små genomiska integreringshotspots. Det är också möjligt att RM-system ofta utnyttjar andra mekanismer som naturlig transformation, vesikler, nanorör, genöverföringsmedel eller generaliserad transduktion för att flytta mellan genom.

Se även

• Metylering
• Restriktionsenzym