Pst I

Pst I är ett restriktionsendonukleas av typ II isolerat från den gramnegativa arten, Providencia stuartii .

Fungera

Pst I klyver DNA vid igenkänningssekvensen 5'-CTGCA/G-3' och genererar fragment med 3'-kohesiva ändar. Denna klyvning ger klibbiga ändar 4 baspar långa. PstI är katalytiskt aktiv som en dimer. igenkänningssekvensens dyadaxel . Den har en molekylvikt på 69 500 och innehåller 54 positiva och 41 negativt laddade rester.

Igenkänningssekvens	Klipp webbplats
5'CTGCAG 3' 3'GACGTC 5'	5'--CTGCA G--3' 3'--G ACGTC—5'

PstI- restriktions-/modifieringssystemet (R/M) har två komponenter: ett restriktionsenzym som klyver främmande DNA och ett metyltransferas som skyddar naturliga DNA-strängar genom metylering av adeninbasen inuti igenkänningssekvensen. Kombinationen av båda tillhandahåller en försvarsmekanism mot invaderande virus. Metyltransferaset och endonukleaset kodas som två separata proteiner och verkar oberoende. I PstI-systemet kodas generna på motsatta strängar och måste därför transkriberas divergent från separata promotorer . Transkriptionsinitieringsställena separeras av endast 70 baspar . En fördröjning i uttrycket av endonukleaset i förhållande till metylas beror på de inneboende skillnaderna mellan de två proteinerna. Endonukleaset är en dimer, som kräver ett andra steg för sammansättning, medan metylaset är en monomer.

PstI är funktionellt ekvivalent med BsuBI. Båda enzymerna känner igen målsekvensen 5'CTGCAG. Enzymsystemen har liknande metyltransferaser (41 % aminosyraidentitet), restriktionsendonukleaser (46 % aminosyraidentitet) och genetisk sammansättning (58 % nukleotididentitet). Dessa observationer tyder på en delad evolutionär historia.

När man undersöker den föredragna dubbelsträngsklyvningen av DNA, binder restriktionsendonukleaset PstI till pSM1-plasmid-DNA.

DNA-kloning

PstI är ett användbart enzym för DNA-kloning eftersom det tillhandahåller ett selektivt system för att generera hybrid-DNA-molekyler. Dessa hybrid-DNA-molekyler kan sedan klyvas vid de regenererade PstI-ställena. Dess användning är inte begränsad till molekylär kloning; det används också vid kartläggning av restriktionsställen, genotypning, Southern blotting, restriktionsfragmentlängdspolymorfism (RFLP) och SNP. Det är också ett isoschizomer restriktionsenzym SalPI från Streptomyces albus P .

Klyvning

PstI klyver företrädesvis renat pSM1-DNA utan att påverkas av substratets superhelicitet. Det är emellertid inte känt om effekterna av denna klyvning inträffar vid bindning till igenkänningsstället eller DNA-klyvning. Dess differentiella klyvningshastigheter vid olika restriktionsställen beror på de fem egenskaperna hos duplexstrukturen. Närheten till ändarna i linjär DNA-molekyl, variation i DNA-sekvens inom igenkänningsställena för enzymer, kort avstånd mellan regioner med ovanliga DNA-sekvenser och igenkänningsställen, och slutligen de speciella strukturerna som slingor och hårnålar. Den samlade effekten av dessa fem faktorer kan påverka tillgängligheten för restriktionsenzymet till dess igenkänningsställen.