Restriktionskarta

För annan användning, se Begränsning (disambiguation) .

En restriktionskarta är en karta över kända restriktionsställen inom en DNA- sekvens . Restriktionskartläggning kräver användning av restriktionsenzymer . Inom molekylärbiologi används restriktionskartor som en hänvisning till ingenjörsplasmider eller andra relativt korta bitar av DNA, och ibland för längre genomiskt DNA. Det finns andra sätt att kartlägga egenskaper på DNA för DNA-molekyler med längre längd, såsom kartläggning genom transduktion .

Ett tillvägagångssätt för att konstruera en restriktionskarta över en DNA-molekyl är att sekvensera hela molekylen och att köra sekvensen genom ett datorprogram som hittar de igenkänningsställen som finns för varje känt restriktionsenzym.

Innan sekvensering automatiserades skulle det ha varit oöverkomligt dyrt att sekvensera en hel DNA-sträng. För att hitta de relativa positionerna för restriktionsställena på en plasmid används en teknik som involverar enkel- och dubbelrestriktionsdigerering. Baserat på storleken på de resulterande DNA-fragmenten kan positionerna för platserna härledas. Restriktionsmappning är en mycket användbar teknik när den används för att bestämma orienteringen av ett insert i en kloningsvektor, genom att kartlägga positionen för ett off-center restriktionsställe i insertionen.

Metod

Den experimentella proceduren kräver först en alikvot av renat plasmid-DNA (se bilagan) för varje digerering som ska köras. Digestion utförs sedan med varje enzym/enzym som valts. De resulterande proverna körs därefter på en elektroforesgel , typiskt på agarosgel .

Det första steget efter att elektroforesen är klar är att lägga ihop storlekarna på fragmenten i varje bana. Summan av de individuella fragmenten bör vara lika med storleken på det ursprungliga fragmentet, och varje digests fragment bör också summeras till samma storlek som varandra. Om fragmentstorlekarna inte stämmer överens finns det två troliga problem. I ett fall kan några av de mindre fragmenten ha runnit av geléns ände. Detta inträffar ofta om gelen körs för länge. En andra möjlig felkälla är att gelén inte var tillräckligt tät och därför inte kunde lösa upp fragment nära stora. Detta leder till en brist på separation av fragment som var nära i storlek. Om alla klyvningar producerar fragment som går ihop kan man sluta sig till positionen för REN-ställena (restriktionsendonukleas) genom att placera dem i fläckar på det ursprungliga DNA-fragmentet som skulle tillfredsställa fragmentstorlekarna som produceras av alla tre klyvningarna

Snabb denaturering och renaturering av ett rå DNA-preparat genom alkalisk lysering av cellerna och efterföljande neutralisering

I denna teknik lyseras cellerna under alkaliska förhållanden. DNA:t i blandningen denatureras (strängar separeras) genom att vätebindningarna mellan de två strängarna bryts. Det stora genomiska DNA:t är föremål för trassel och förblir denaturerat när pH sänks under neutraliseringen. Med andra ord, strängarna kommer tillbaka tillsammans på ett oordnat sätt, basparar slumpmässigt. De cirkulära supercoiled plasmidernas strängar kommer att förbli relativt nära inriktade och kommer att renatureras korrekt. Därför kommer det genomiska DNA:t att bilda ett olösligt aggregat och de superlindade plasmiderna kommer att lämnas i lösning. Detta kan följas av fenolextraktion för att avlägsna proteiner och andra molekyler. Därefter kan DNA:t utsättas för etanolfällning för att koncentrera provet.

Se även

• Vector NTI , bioinformatikprogramvara som används bland annat för att förutsäga restriktionsställen på en DNA-vektor
• RFLP , metod som bland annat används för att differentiera oerhört lika genom