Cluster of Excellence Frankfurt makromolekylära komplex

Cluster of Excellence Frankfurt "Macromolecular Complexes" ( CEF ) etablerades 2006 av Goethe University Frankfurt tillsammans med Max Planck Institute of Biophysics och Max Planck Institute for Brain Research inom ramen för German Universities Excellence Initiative . Finansiering av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) slutet i oktober 2019. CEF växte fram ur den långvariga samarbetsforskningen om membranproteiner och RNA- molekyler och stärkte forskningsinsatserna inom dessa områden genom att rekrytera ytterligare forskare till Frankfurt/Main. CEF samlade forskningsverksamheten för upp till 45 forskargrupper, varav de flesta var baserade på Riedberg Campus i Frankfurt/Main . CEF grundade Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS) .

Mål

CEF-forskare satte sig för att undersöka strukturen och funktionen hos stora makromolekylära komplex, särskilt membranproteiner och deras sammansättningar, komplex involverade i signaltransduktion och kvalitetskontroll, och RNA-proteinkomplex.

Forskning

Viktiga strukturer av makromolekylära komplex bestämdes i CEF. Exempel på viktiga membrankomplex inkluderar atomstrukturerna av komplex I och ATP-syntaset i den mitokondriella andningskedjan och av transportören associerad med antigenbearbetning (TAP). Forskning om RNA- struktur och funktion ledde till definitionen av reglerande principer för temperaturavkännande riboswitchar , struktur-funktionsförhållandet för RNA-polymeras I , funktionerna hos mikroRNA och mekanismerna för rRNA- mognad och nedströmsprocesser under ribosombiogenes och återvinning. Till exempel identifierade CEF-forskare receptorerna för ubiquitin- kedjor på proteasomen , dechiffrerade rollen av linjära ubiquitin-kedjor och beskrev makromolekyler som reglerar mitofagi , xenofagi och ER-fagi. De avgränsade rollen av sumoylering i ribosomkvalitetskontroll och karakteriserade processen för genetisk kvalitetskontroll i oocyter . Insatserna inom dessa tre forskningsområden åtföljdes av tillvägagångssätt för att designa eller omprogrammera makromolekylära komplex och nya metoder utvecklade för att utöka den redan starka expertisen. CEF-forskare etablerade och avancerade principerna för optogenetik såväl som biokemiska metoder för ljusreglering. De utvecklade också biofysiska tekniker för strukturell och funktionell karakterisering av makromolekyler. Exempel inkluderar ljusomkopplingsbara molekyler designade för applikationer i cellen och tidsupplösta tekniker för att studera RNA-veckning. Ljusarkfluorescensmikroskopi för observation av utveckling och LILBID- masspektrometri för analys av membrankomplex förbättrades. PELDOR-EPR utvecklades till en upplösning som tillåter mätningar i cellen. Klustret främjade vetenskapligt utbyte genom en rad program samt genom workshops, internationella konferenser och föreläsningsserier. Optogenetik och ljusarksfluorescensmikroskopi valdes ut som "Årets metod" inom alla vetenskaps- och ingenjörsområden av den tvärvetenskapliga forskningstidskriften Nature Methods 2010 respektive 2014.

De fem forskningsområdena för CEF inkluderade: (A) Struktur, mekanismer och dynamik hos komplex i membranet, (B) Sammansättning och dynamik hos makromolekylära komplex i kvalitetskontroll och signalering, (C) Dynamik hos ribonukleinsyra-protein-komplex, ( D) Design av makromolekylära komplex, och (E) Metoder för att studera makromolekylära komplex.

CEF Forskningsområde A - Struktur, mekanismer och dynamik hos komplex i membranet

Biologiska membran har en mycket viktig roll i livsprocesser eftersom allt en cell behöver för att leva, växa och svara måste antingen passera eller agera på dem. Energiomvandlingsprocesserna för cellandning och fotosyntes sker i membran, varje sensorisk stimulans och informationsbehandlingen i hjärnan förmedlas av dem. Denna rad olika åtgärder utförs av ett stort antal olika membranproteiner . I de trånga förhållandena i cellmembranet associeras de flesta membranproteiner till komplexa dynamiska sammansättningar för att utföra sina olika uppgifter. Av denna anledning, och eftersom de är inbäddade i lipiddubbelskiktet av membranet, är de flesta membranproteiner svåra att studera och deras funktioner har ofta varit svårlösta. CEF-forskare har gjort banbrytande arbete för att övervinna några av dessa utmaningar och gjort stora bidrag till att klarlägga strukturen, mekanismerna och regleringen av ett antal viktiga stora komplex, inklusive andningskomplex I , roterande ATPaser , superkomplex I 1 III 2 IV 1 , cytokrom cbb3 oxidas, cytokrom bd-oxidas, ett sulfid:kinonoxidoreduktas, ett svamp-TOM-kärnkomplex, ett bakteriellt dubbelporigt K+-upptagssystem KtrAB, den Na+-oberoende karnitin/butyrobetain-antiportern CaiT, betain/Na+-symportören BetP, transportören Acrflux och chaperonen och redigeringskomplexet TAPBPR–MHC I och det humana MHC-I-peptidladdande komplexet. Antigenisk peptidigenkänning på TAP löstes genom DNP-förstärkt NMR-spektroskopi i fast tillstånd. Den konformationella kopplingen och trans-inhiberingen i den humana antigentransportörortologen TmrAB löstes med hjälp av dipolär EPR-spektroskopi. Framstegen inom 3D-strukturbestämning av membranproteiner genom röntgenkristallografi och kryoelektronmikroskopi har skapat en ökande efterfrågan och möjlighet till djupgående mekanistiska studier med magnetiska resonansmetoder. På grund av de utmaningar som är inneboende för membranproteiner, är framsteg beroende av tillgången på tekniker i framkant av metodutveckling. Särskilt solid-state (MAS) NMR gör det möjligt att överbrygga gapet mellan "statiska" strukturer och biokemiska data genom att sondera membranproteiner direkt i dubbelskiktsmiljön. Sådana experiment är utmanande och genombrott kunde bara uppnås tack vare tillgången på dynamisk kärnpolarisering för känslighetsförbättring och mycket höga magnetfält för spektral upplösning. CEF-forskare kunde ge nya insikter om den katalytiska mekanismen hos ABC-transportörer. Baserat på 31P-MAS-NMR i realtid fann de att den homodimera lipiden A flippas MsbA kan katalysera en omvänd adenylatkinasliknande reaktion förutom ATP-hydrolys. Dessutom undersöktes ATP-hydrolyscykeln för ABC-transportören LmrA genom platsriktad spin-märkning och pulsad elektron-elektron dubbelresonans (PELDOR/DEER) spektroskopi. Den sekundära multiläkemedelsutflödespumpen EmrE från E. coli studerades omfattande med 31P- och DNP-förstärkt solid-state NMR. Dessutom är ett antal fotoreceptorer såsom mikrobiella rhodopsiner involverade i trans-membran transportprocesser. Till exempel gjordes grundläggande bidrag till den strukturella och funktionella beskrivningen av proteorhodopsin, en pentamerisk ljusdriven protonpump av grupper inom CEF. CEF-forskare har utvecklat masspektrometrimetoder speciellt lämpliga för stora membranproteinkomplex. Laserinducerad vätskestråle/pärljondesorptionsmasspektrometri (LILBID) möjliggör massanalys av helmembranproteinkomplex på 1 MDa eller mer. Ett team av CEF-forskare löste mekanismen för subtypselektiviteten hos mänskliga bradykininreceptorer för deras peptidagonister genom att integrera DNP-förstärkt kärnmagnetisk resonans i fast tillstånd med avancerad molekylär modellering och dockning

CEF Forskningsområde B - Sammansättning och dynamik hos makromolekylära komplex inom kvalitetskontroll och signalering

Karakteriseringen av funktion och strukturell sammansättning av signalkomplex som kontrollerar cellulära kvalitetskontrollprogram var ett av huvudämnena i CEF-forskningen. Synen att proteiner fungerar som enstaka enheter har ersatts med konceptet som tyder på att dynamisk omorganisation av multimera lösliga komplex annoterade som signalosomer är avgörande för signalöverföring i cellen. Reglering av aktiviteten hos dessa komplex uppnås genom deras dynamiska sammansättning såväl som genom post-translationella modifieringar ( PTM) av proteiner. Domäner som känner igen dessa modifieringar spelar en avgörande roll för en cells förmåga att svara på förändringar i deras mikromiljö. Betydande framsteg har gjorts av CEF när det gäller att karakterisera flera signalvägar och deras reglering av PTM inklusive ubiquitylering , fosforylering och acetylering . Ett särskilt fokus för forskning inom CEF har varit på proteinkvalitetskontrollmekanismer som är grunden för de autofagiska och ubiquitin/proteasomala vägarna, de två cellulära system som används för att bryta ned felaktiga eller överflödiga proteiner, komplex och organeller. Ytterligare fokus för CEF-forskning var genetisk kvalitetskontroll i oocyter och epitelstamceller genom p53 - proteinet och reglering av och av kinaser .

Forskning om autofagi

Under selektiv autofagi är last specifikt inriktat på nedbrytning, och distinkta lastreceptorer har beskrivits som reglerar selektivitet. Denna process underlättas av autofagireceptorer som specifikt känner igen och binder sin last och levererar den till fagoforen. Hos människor finns det sex olika LC3/ GABARAP -proteiner, som spelar en central roll genom att koppla ihop begynnande autofagosommembran och lastladdade autofagireceptorer för att underlätta uppslukning, ibland medierad eller stödd av ytterligare adapterproteiner. CEF-forskare visade att GABARAP-proteiner inte bara är involverade i autofagi utan också i den ubiquitinberoende nedbrytningen av TIAM1 . Genombrott uppnåddes i hur celler bekämpar intracellulära patogener och hur intracellulära bakterier försöker undvika dessa motåtgärder. Kinaset Tbk1 identifierades som viktigt för att förmedla optineurinbaserad xenofagi för att avlägsna bakterierna från de infekterade cellerna. Med hjälp av masspektrometri genomfördes en global analys av ubiquitinomen av Salmonella -infekterade celler, som gjorde det möjligt för CEF-forskare att identifiera specifika mål av bakteriella ligaser som utsöndras i cellcytoplasman av patogenerna. CEF-forskare avslöjade också den molekylära mekanismen för en ny typ av fosforibosyl-kopplad serin ubiquitination av effektorn SdeA av patogenen Legionella , som skiljer sig mycket från den kanoniska lysin -baserade ubiquitination mekanismen. De visade vidare att en annan effektor av Legionella -bakterier, SidJ, motsätter sig SidEs toxicitet i jäst- och däggdjursceller. Massspektrometrianalys avslöjade att SidJ är ett glutamylas som modifierar det katalytiska glutamatet i mono-ADP-ribosyltransferasdomänen i SdeA, vilket blockerar SdeA:s ubiquitinligasaktivitet. De upptäckte vidare att retikulontypproteiner fungerar som ER-specifika autofagireceptorer och simulerade deras effekt på membrankrökningen.

Ubiquitination

Ubiquitination spelar en central roll för att markera proteiner som ska brytas ned antingen via autofagivägen eller via proteasomen . Flera grupper av CEF har bidragit till framsteg i att förstå hur ubiquitin-signalering inte bara används som en nedbrytningssignal utan också involverat i flera andra cellulära processer

s63

Forskning på TP63 , även känd som p63, har visat att detta protein spelar väsentliga roller både för proliferation och differentiering av stratifierade epitelvävnader såväl som för övervakningen av den genetiska kvaliteten i kvinnliga könsceller. Undersökningar av CEF-forskare visade att en specifik isoform av p63 uttrycks i hög grad i primordiala oocyter som stoppas i profas av meios I. Denna isoform antar en sluten, inaktiv och endast dimer konformation där både interaktionen med DNA:t och med transkriptionsmaskineriet reduceras avsevärt. Hämningen uppnås genom att blockera tetrameriseringsgränssnittet för oligomeriseringsdomänen med ett sexsträngat antiparallellt beta-ark. Aktivering kräver fosforylering och följer en fjäderbelastad, irreversibel aktiveringsmekanism. Dessa upptäckter öppnar möjligheten att utveckla en terapi för att bevara oocyter under kemoterapi som hos kvinnliga cancerpatienter vanligtvis resulterar i infertilitet och för tidigt insättande av klimakteriet . CEF-forskare hjälpte också till att identifiera den molekylära mekanismen som orsakar ankyloblepharon-ektodermalt dysplasi-läpp/gomspaltsyndrom, en sjukdom som kännetecknas av huderosion, orala klyvavvikelser och sammansmälta ögonlock, som är baserad på mutationer i SAM-domänen eller i C-terminalen av p63. Komplex involverade i tumörbildning studerades av flera CEF-grupper, inklusive det leukemogena AF4-MLL-fusionsproteinet och RIP1-innehållande cytosoliska komplex som är avgörande för initiering och finjustering av olika former av celldöd , dvs. apoptos och nekroptos

SGC Frankfurt

Goethe University blev medlem i Structural Genomics Consortium (SGC) 2017, ett internationellt konsortium och offentlig-privat partnerskap dedikerat till bestämning av strukturer för viktiga proteiner och utveckling av inhibitorer och sonder för biologiska makromolekyler som ska användas i funktionella undersökningar. Goethe-universitetet har också blivit hem- och referenscentrum för SGC:s donerade sondprogram, som gör att små molekyler inte längre efterföljs av industrin som läkemedelsmål fritt tillgängliga för forskare över hela världen). CEF-forskare har utvecklat bromodomain-hämmare som kan användas för att studera funktionen hos dessa acetyl-lysinmodifieringsbindande domäner. En uppsättning sönder har karakteriserats och validerats som verktyg för specifika bromdomäner

Interaktioner med lösliga domäner vid membranet

CEF visade att vaskulär endoteltillväxtfaktorreceptor -2 måste internaliseras och regleras av dess association till efrin Bs i endotelceller. EphrinBs visade sig också vara väsentliga för att kontrollera nivåerna av AMPA-receptorer vid det synaptiska membranet. Mekanismen för membraninsättning av svansförankrade proteiner studerades genom strukturell och biokemisk karakterisering av interaktionen mellan det lösliga Get3-proteinet och de cytoplasmatiska domänerna av de membranbundna receptorerna Get1 och Get2.

CEF Forskningsområde C - Dynamik hos ribonukleinsyra-protein-komplex

Många upptäckter inklusive identifieringen av flera klasser av icke-kodande RNA och regulatoriska RNA-element har vidgat perspektivet på RNA-funktion från en passiv bärare av information till en aktiv cellulär komponent. Dess strukturella och funktionella beskrivning krävs för att förstå de molekylära interaktionerna och den inblandade dynamiken.

Strukturell beskrivning av RNA-element och deras dynamik

Kombinationen av högupplöst NMR-baserad analys av RNA-strukturer och tidsupplöst ligand-inducerad återveckning av RNA genom att inkapsla distinkta konformationer tillsammans med pulsade elektroner paramagnetiska resonansmetoder (PELDOR) efter basspecifik spin-märkning och ultrasnabb laserspektroskopi av RNA dynamik har lett till beskrivningen av den strukturella dynamiken hos flera RNA. CEF-forskare visade att regleringsmekanismen för den adeninavkännande riboswitchen från den mänskliga patogena bakterien Vibrio vulnificus skiljer sig markant från en tvåtillståndsomkopplarmekanism genom att den involverar tre distinkta stabila konformationer. Denna translationella adeninavkännande riboswitch representerade det första exemplet på ett temperaturkompenserat regulatoriskt RNA-element. Sammansättningen och strukturen av HIV TAR RNA-Ligand-komplexet analyserades med LILBID och NMR , vilket ledde till en beskrivning av komplexiteten hos peptidbindningsställen i RNA. Dessutom analyserades den guaninavkännande riboswitch- aptamer- domänen av Bacillus subtilis xpt-pbuX operon , Diels-Alderase ribozymes en RNA-baserad termometer och N1- ribostamycinkomplexet strukturellt och funktionellt. CEF-forskare visade också att för den guaninavkännande xpt-pbuX riboswitch av B. subtilis är konformationen av fullängdstranskripten statisk: den fyller uteslutande det funktionella off-tillståndet men kan inte växla till på-tillståndet, oavsett närvaro eller frånvaro av ligand. Endast den kombinerade matchningen av transkriptionshastigheter och ligandbindning gör det möjligt för transkriptionsintermediärer att genomgå ligandberoende konformationell återveckning (Steinert et al., 2017).

Komponenter involverade i ribosombiogenes i eukaryoter

CEF-forskare i samarbete med Max Planck Institute for Biophysical Chemistry visualiserade RNA-polymeras I (Pol I) i processen att aktivt transkribera ribosomgener i en cellulär miljö och löste dess struktur med och utan nukleinsyror vid 3,8 Å-upplösning med cryo-EM . Deras strukturer förklarade regleringen av transkriptionsförlängning där kontrakterade och expanderade polymeraskonformationer är associerade med aktiva respektive inaktiva tillstånd.

Arbete genom ett samarbete mellan flera CEF-grupper avslöjade den molekylära naturen hos Bowen-Conradi syndrom genom att visa att den sjukdomsframkallande punktmutationen av ribosombiogenesfaktorn Nep1 försämrar dess nukleolära lokalisering och RNA-bindning. En annan studie, i samarbete med Edinburg University, analyserade RNA-helikas Prp43 genom tvärbindning av RNA och analys av cDNA (CRAC) och gav första insikter om detta enzyms funktionella roller i ribosombiogenes CEF-forskare identifierade också växtspecifika ribosombiogenesfaktorer i A. thaliana med väsentlig funktion i rRNA- bearbetning och visade att den 60S -associerade ribosombiogenesfaktorn LSG1-2 krävs för 40S -mognad i A. thaliana .

Distribution av RNA-modifierande enzymer och RNA-molekyler

Dynamiken hos RNPs i naturliga miljöer i eukaryota celler visualiserades och kvantifierades med hjälp av högupplöst mikroskopi. Adenosin-till-inosin (A-till-I) RNA-redigering, som katalyseras av adenosindeaminas som verkar på RNA (ADAR)-enzymer, är viktig i den epitranskriptomiska regleringen av RNA-metabolism. Cathepsin S (CTSS) mRNA, som kodar för ett cysteinproteas associerat med angiogenes och ateroskleros , visade sig vara högredigerat i humana endotelceller . A-till-I RNA-redigering kontrollerar cathepsin S-uttryck i ateroskleros genom att möjliggöra HuR-medierad post-transkriptionell reglering.

mRNA-export från kärnan till cytoplasman är ett mycket reglerat steg i genuttryck . CEF-forskare utvärderade medlemmar av SR- proteinfamiljen (SRSF1–7) för deras potential att fungera som adaptrar för nukleär exportfaktor 1 (NXF1) och därigenom koppla pre-mRNA-bearbetning till mRNA-export. De fann att >1000 endogena mRNA krävde individuella SR-proteiner för nukleär export in vivo . För att ta itu med mekanismen transkriptomomfattande RNA-bindande profiler för NXF1 och SRSF1-7 parallellt genom UV-tvärbindning med individuell nukleotidupplösning och immunoutfällning ( iCLIP ). SRSF3 dök upp som den mest potenta NXF1-adaptern, vilket gav sekvensspecificitet till RNA-bindning av NXF1 i sista exoner. Många mänskliga sjukdomar kännetecknas av en utbredd dysreglering av RNA-bindande proteiner (RBP) och massivt förändrade transkriptommönster . CEF-forskare använde beräkningsmetoder för att studera mekanismerna för posttranskriptionell reglering på en transkriptomisk skala, i samarbete med forskare vid IMB Mainz .

Icke-kodande RNA

CEF-forskare undersökte också inflytandet av nya |icke-kodande RNA]], såsom långa icke-kodande RNA (lncRNA) och mikroRNA (miRNA), på cellulär funktion. miRNA reglerar genuttryck genom att binda till mål-mRNA och förhindra deras translation. Ett av CEF Focus-projekten lyckades observera den aktivitetsberoende spatialt lokaliserade miRNA-mognaden i neuronala dendriter . Lokal mognad av miRNA visade sig vara associerad med en lokal minskning av proteinsyntes, vilket visar att lokaliserad miRNA-mognad kan modulera målgenuttryck med lokal och tidsmässig precision. LncRNA Meg3 visade sig kontrollera endotelcellernas åldrande och dess hämning kan fungera som en potentiell terapeutisk strategi för att rädda åldringsmedierad försämring av endotelcellernas funktion. LncRNA MALAT1 visade sig reglera endotelcellsfunktion och kärltillväxt. och skyddar mot åderförkalkning genom att reglera inflammation .

CEF Forskningsområde D - Design av makromolekylära komplex

Ett stort fokus för arbetet i CEF var att utveckla och använda metoder och att utforska proteiner som möjliggör modulering av cellulär och molekylär funktion med ljus. Inom området optogenetik uppnås kontroll av membranpotential och intracellulär signalering i neuroner och andra celler genom uttryck av fotosensorproteiner, i de flesta fall av mikrobiellt ursprung, t.ex. jonkanaler eller pumpar, såväl som ljusaktiverade enzymer. Optokemiska metoder, däremot, använder kemiskt framställda molekyler för att uppnå ljuseffekter i biologisk vävnad.

Optogenetik

Ursprunget till optogenetik ligger i Bamberg-gruppens arbete vid MPI of Biophysics i Frankfurt, som visade att channelrhodopsin-2 (ChR2) är en ljusstyrd katjonkanal som kan depolarisera cellerna där den uttrycks. Under CEF fortsatte Bamberglaboratoriet att arbeta inom detta område och bidrog med flera viktiga artiklar, t.ex. om karakterisering men också om konstruktion av ChR2 till optogenetiska verktyg med olika egenskaper. Den första användningen av ChR2 för depolarisering av däggdjursceller och generering av det första ChR2-transgena djuret ägde rum i Frankfurt. Gottschalk-labbet introducerade ChR2, den ljusdrivna Cl-pumpen halorhodopsin och andra rhodopsiner i nervsystemet hos nematoden C. elegans , för att stimulera enstaka neuroner och korrelera deras funktion med en beteendemässig uteffekt. Dessutom studerade de synaptisk transmission efter fotostimulering , med hjälp av ChR2 och ett fotoaktiverat adenylylcyklas (PAC), i kombination med elektrofysiologi och elektronmikroskopi, och introducerade modifierade eller nya optogenetiska verktyg med förändrade egenskaper, för att blockera synaptisk transmission , eller för att manipulera cyklisk GMP . Flera CEF-grupper gick samman för att inte bara reda ut fotocykeln för ChR2 vid olika tidsskalor utan gav också, i samarbete med Research Center Juelich, strukturella insikter om jonledning av ChR2. De genererade också flera mutanta ChR2-versioner med förändrad jonkonduktans (till exempel ökad Ca 2+ -permeabilitet i "CatCh", en Ca 2+ -transporterande kanalrodopsin) eller kinetik, vilket representerar mycket användbara tillägg till den optogenetiska verktygslådan. År 2015 presenterade CEF-forskare den första NMR- studien som löste strukturella detaljer för den retinala kofaktorn av ChR2. Denna studie var endast möjlig eftersom DNP (en hybridmetod som länkar EPR med solid-state NMR-spektroskopi ) ökade detektionskänsligheten 60 gånger så att metastabila intermediärer kunde detekteras. På detta sätt gavs första entydiga bevis för en exklusiv all-trans retinal konformation i mörkt tillstånd och en ny fotointermediär kunde identifieras. Studien visade att DNP-förstärkt solid-state NMR är en nyckelmetod för att överbrygga gapet mellan röntgenbaserad strukturanalys och funktionella studier mot en högupplöst molekylär bild.

Det framkom gradvis att rhodopsiner har ett brett spektrum av funktioner och utbredning och finns i alla livsfylor . Med de nya rhodopsinerna kom observationen att de representerar en ganska mångsidig familj av proteiner samtidigt som de behåller den strukturella ställningen av sju transmembranspiraler med en retinal kromofor bunden till ett konserverat lysin . CEF-forskare har studerat strukturen och funktionen av mikrobiella rhodopsiner. En av dessa är proteorhodopsin , som finns i marina mikrober, som är den vanligaste näthinnebaserade fotoreceptorn på vår planet. Varianter av proteorhodopsiner visar höga nivåer av miljöanpassning, eftersom deras färger är inställda på den optimala våglängden av tillgängligt ljus.

CEF-forskare tillsammans med kollegor från andra tyska universitet utvecklade ett nytt tillvägagångssätt för att förändra de funktionella egenskaperna hos rhodopsin optogenetiska verktyg, nämligen genom modifieringar av retinala kromoforen. Syntetiska retinala analoger introducerades i ChR2 eller andra rhodopsinverktyg i C. elegans , Drosophila och mänskliga celler, för att ändra ljuskänsligheten, fotocykelkinetiken och färgspektrumet hos de optogenetiska ställdonen. De etablerade också det hårt ljusreglerade guanylyl-cyklas- opsinet CyclOp som möjliggjorde snabb ljusutlöst cGMP-ökning. CEF-forskare har också använt optogenetiska verktyg för analys av neurala kretsar och hur de driver beteende.

Optokemiska tillvägagångssätt

För att kontrollera proteiner och nukleinsyror med ljus har CEF-forskare designat och applicerat en rad fotoväxlingsbara tjuder, ribonukleosider och nukleinsyror, RNA-aptamerer och "beacons". De utvecklade också ett tillvägagångssätt för kemo-enzymatisk syntes av positionsspecifikt modifierat RNA för biofysikaliska studier inklusive ljuskontroll. Dessutom realiserades ljusaktiverbar interaktion av DNA-nanoarkitekturer, ljusberoende konformationsförändringar i nukleinsyror, ljusberoende RNA-interferens och ljusberoende transkription. Våglängdsselektiv ljus-triggning etablerades för nukleinsyror såväl som tredimensionell kontroll av DNA-hybridisering genom ortogonal tvåfärgsupptagning av två-fotoner. CEF-forskare utvecklade en rödförskjuten två-foton-endast burgrupp för tredimensionell fotorelease. De utvecklade också en minimal ljusväxlingsbar modul som möjliggör bildandet av en intermolekylär och konformationellt väldefinierad DNA G-quadruplex- struktur med en fotoväxlingsbar azobensenrest som en del av ryggradsstrukturen. Viktigt var också utvecklingen av en inducerbar fluorescerande sond som möjliggjorde detektering av aktivitetsberoende rumsligt lokaliserad miRNA-mognad i neuronala dendriter . Med hjälp av ljusinducerbara antimiRs undersökte CEF-forskare också om lokalt begränsad mål- miRNA- aktivitet har en terapeutisk fördel vid diabetisk sårläkning och fann att ljus kan användas för att lokalt aktivera terapeutiskt aktiva antimiRs in vivo .

Nya byggnadsprinciper för DNA-nanoarkitekturer har etablerats i CEF. Dessutom har nya RNA- riboswitchar designats som kan triggas med små metaboliter , exogena molekyler eller genom temperaturförändringar, samt aptamerer eller självklyvande ribozymer , som kan användas för att kontrollera genuttryck in vivo . För att göra makromolekyler ytterligare tillgängliga på nanoskalan för manipulation, utvecklade CEF allmänt tillämpbara metoder för att organisera makromolekylära komplex i två dimensioner med mycket hög precision, såväl som små syntetiska gatekeepers och nya "ljusbrytare" för att kontrollera biomolekylära interaktioner och sammansättning av makromolekylära komplex Ett tillvägagångssätt för att montera tredimensionella proteinnätverk genom två-fotonaktivering utvecklades. CEF-forskare uppnådde också optisk kontroll av antigentranslokation med hjälp av syntetiska fotovillkorliga virala hämmare.

Proteinteknik

CEF-forskare använde detaljerad strukturell kunskap om megakomplexet fettsyrasyntas (FAS) för att konstruera FAS för biosyntes av kortkedjiga fettsyror och polyketider , styrt av en kombinerad in vitro och in silico- metod. De omprogrammerade kedjelängdskontrollen av FAS av Saccharomyces cerevisiae för att skapa en bagerijäst som kan producera kortkedjiga fettsyror. En rationell och minimalt invasiv proteinteknik användes som lämnade de molekylära mekanismerna för FAS oförändrade och identifierade fem mutationer som kan få bagerijäst att producera kortkedjiga fettsyror. För att manipulera en proteinfotocykel på ett riktat sätt, samarbetade CEF-grupper för att modifiera flavoproteinet dodecin vid dess nyckelaminosyra tryptofan med substituenter noggrant utvalda för deras strukturella och elektroniska inflytande.

CEF Forskningsområde E - Metoder för att studera makromolekylära komplex

Utvecklingen av banbrytande metoder, inklusive elektronparamagnetisk resonans (EPR), tidsupplöst kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR), avancerad fluorescensmikroskopi , samt optogenetik och optokemisk biologi har varit avgörande för CEF:s forskningsansträngningar. Klustret integrerade också nya utvecklingar inom elektronmikroskopi och tomografi samt inom superupplösningsmikroskopi i metodportföljen på Riedberg Campus.

Kryo-elektronmikroskopi

Kryoelektronmikroskopi , Årets naturmetod 2015 och metoden för vilken ett Nobelpris delades ut 2017, användes flitigt av flera CEF-grupper, vid MPI of Biophysics samt vid Goethe-universitetets Buchmann Institute for Molecular Biology . Direktelektrondetektorer, i utvecklingen av vilka MPI of Biophysics var involverad, har överträffat alla förväntningar. Med dessa detektorer kan bilder fångas med mycket högre kontrast än med de CCD-kameror som tidigare använts och har lett till fantastiska framsteg inom strukturbiologin. Genom att investera i denna nya teknologi har CEF-medlemmar kunnat påskynda strukturbestämningen och även lösa strukturerna hos makromolekylära komplex som inte var mottagliga för röntgenkristallografistudier . Ett annat fokus för CEFs elektronmikroskopister var att avslöja den makromolekylära organisationen av levande celler med hjälp av kryoelektrontomografi . Cryo-ET är den enda tekniken som kan erhålla bilder med molekylär upplösning av intakta celler i en kvasi-nativ miljö. Sådana tomogram innehåller en stor mängd information eftersom de i huvudsak är en tredimensionell karta över det cellulära proteomet och visar hela nätverket av makromolekylära interaktioner. Algoritmer för informationsutvinning utnyttjar strukturella data från olika tekniker, identifierar distinkta makromolekyler och anpassar beräkningsmässigt atomära upplösningsstrukturer i de cellulära tomogrammen, och överbryggar därigenom upplösningsgapet.

Ljusmikroskopi

Klustret stöder också starkt nya utvecklingar inom avancerad ljusmikroskopi. En särskilt viktig teknik som CEF lagts till i forskningsteknikportföljen i Frankfurt är ljusarkfluorescensmikroskopi (LSFM)). I LSFM minimerar optisk sektionering i excitationsprocessen fluoroforblekning och fototoxiska effekter. Eftersom biologiska prover med LSFM överlever långvarig tredimensionell avbildning med hög spatiotemporal upplösning, har sådana mikroskop blivit det bästa verktyget inom utvecklingsbiologi . Effekten av LSFM uppmärksammades 2015, när tidskriften Nature Methods valde den till "Årets metod 2014". CEF-forskare använde till exempel LSFM för att i detalj avbilda den fullständiga embryonala utvecklingen av olika evolutionära orelaterade insekter och för att fastställa reglerna och självorganiserande egenskaper för celldelningsmönster för post-embryonala växtorgan. Den stora mängden data som produceras av avancerad ljusmikroskopi har gjort automatiserad bildanalys till en nödvändighet och CEF har bidragit till förbättrad databearbetning och modellering av avancerad ljusmikroskopidata. Andra nya ljusmikroskopitekniker som används av CEF-forskare inkluderar tekniker som ger en molekylär känslighet och en rumslig upplösning under diffraktionsgränsen för att studera den strukturella organisationen av biomolekyler i celler. Mjukvaruverktyg som utvecklats av CEF-forskare inkluderar till exempel SuReSim, en programvara utvecklad i samarbete med Heidelberg University, som simulerar lokaliseringsdata av godtyckliga tredimensionella strukturer representerade av grundsannningsmodeller, vilket gör det möjligt för användare att systematiskt utforska hur förändrade experimentella parametrar kan påverka potentiella bildresultat. . Med hjälp av de nyutvecklade teknikerna kunde CEF-forskare fastställa rollen för den linjära ubiquitinpälsen runt cytosolpatogenen Salmonella Typhimurium som den lokala NF-KB-signaleringsplattformen och gav insikter om OTULINs funktion i NF-KB-aktivering under bakteriell patogenes. Ett annat exempel är identifieringen av retikulon 3 (RTN3) som en specifik receptor för nedbrytning av ER- tubuli. Det nära samarbetet mellan konsortiet gjorde det möjligt att ta itu med två stora utmaningar inom mikroskopi av levande celler och enkelmolekyler: effektiv leverans av fluoroforer över cellmembran och högdensitetsproteinspårning med ultrasmå etiketter. Tillsammans ger de nya verktygen ytterligare vägar för att specifikt manipulera och fånga cellulära proteiner, och samtidigt för högupplöst avläsning genom enkelmolekylbaserad mikroskopi.

Spektroskopimetoder

Ett brett utbud av spektroskopimetoder för biologiska tillämpningar fanns tillgängliga inom CEF och CEF-forskare har gjort betydande framsteg i att vidareutveckla biomolekylär NMR och EPR. Medlemmarna av Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ) förbättrade känsligheten för flytande och fast tillstånd NMR med en spektrometer med dynamisk kärnpolarisation (DNP). Tillsammans med forskare från Ryska vetenskapsakademin utvecklade CEF-forskare en högeffektsgyrotronkälla för DNP. Källan arbetar på 260 GHz med en uteffekt på 20 W, och är ansluten med en kvasi-optisk vågledare till en flytande och en solid-state 400 MHz NMR-spektrometer. Mikrovågskortet, som detekterar EPR-signalen och ansluter högeffektmikrovågskällan till NMR-sonden, konstruerades i samarbete med forskare från den ukrainska vetenskapsakademin . Denna unika enhet är baserad på ett metallo-dielektriskt vågledarsystem, vilket garanterar ultralåga förluster i kombination med en hög grad av flexibilitet vad gäller instrumentdesign. CEF:s forskare visade en proton-NMR-signalförbättring i vattenhaltiga vätskor med upp till 80-faldigt vid magnetfält på 9.T, vilket översteg teoretiska förutsägelser med mer än en faktor 20. De första tillämpningarna på makromolekylära komplex har varit lika framgångsrika. De registrerade också signalförbättringar med en faktor upp till 40 under magiska vinkelprovspinningsförhållanden (MAS) vid 100 K med proteorhodopsin rekonstituerad till lipiddubbelskikt . Genom att integrera DNP-förstärkt NMR-spektroskopi i fast tillstånd med avancerad molekylär modellering och dockning, löstes mekanismen för subtypselektiviteten hos humana kinin G-proteinkopplade receptorer för deras peptidagonister. DNP-förstärkt NMR-spektroskopi i fast tillstånd gjorde det möjligt för CEF-forskare att fastställa ryggradskonformationen med atomupplösning hos en antigen peptid bunden till den mänskliga ABC-transportören TAP . Deras NMR-data gav också oöverträffade insikter i naturen av interaktionerna mellan sidokedjorna av antigenpeptiden och TAP. Deras resultat avslöjade en strukturell och kemisk grund för substratvalsregler, som definierar den avgörande funktionen för denna ABC-transportör i mänsklig immunitet och hälsa. Detta arbete var den första NMR-studien av ett eukaryotiskt transportörproteinkomplex och visade kraften hos solid-state NMR på detta område. De visade också kraften hos DNP-förstärkt solid state-NMR för att överbrygga gapet mellan funktionella och strukturella data och modeller. Parallellt med DNP-utvecklingen konstruerades en pulsad elektron-elektron dubbelresonans (PELDOR) spektrometer med ett magnetfält på 6,4 T. En proteinkoncentration på endast 10 pMol är tillräcklig för en mätning vid 40 K. Med detta instrument kunde CEF-forskare bestämma den dimera strukturen hos icke-kovalenta proteinkomplex. Denna metod är också tillämpbar på membranproteiner och spinnmärkta RNA- och DNA -molekyler in vivo . PELDOR-spektroskopi visade sig vara ett mångsidigt verktyg för strukturella undersökningar av proteiner, även i den cellulära miljön. För att till exempel undersöka de strukturella implikationerna av de asymmetriska nukleotidbindande domänerna och trans-inhiberingsmekanismen i TAP-ortologer, introducerades spin-label-par via dubbla cysteinmutanter vid de nukleotidbindande domänerna och transmembrandomänerna i TmrAB (en funktionell homolog av det humana antigentranslokationskomplexet TAP) och konformationsförändringarna och jämviktspopulationerna följde med användning av PELDOR-spektroskopi. Denna studie definierade den mekanistiska grunden för trans-inhibering, som fungerar genom en omvänd övergång från det utåtvända tillståndet genom en tilltäppt konformation. Resultaten avslöjade den centrala rollen av reversibel konformationsjämvikt i funktionen och regleringen av en ABC-exportör och etablerade ett mekanistiskt ramverk för framtida undersökningar av andra medicinskt viktiga transportörer med präglad asymmetri. Studien visade också för första gången möjligheten att lösa jämviktspopulationer vid flera domäner och deras ömsesidiga beroende för globala konformationsförändringar i ett stort membranproteinkomplex.

Masspektrometri

Infödd masspektrometri har dykt upp som ett viktigt verktyg inom strukturbiologin . Fördelarna med masspektrometri jämfört med andra metoder som röntgenkristallografi eller kärnmagnetisk resonans är till exempel dess lägre detektionsgränser, dess hastighet och dess förmåga att hantera heterogena prover. CEF bidrog till utvecklingen av laserinducerad flytande pärljondesorptionsmasspektrometri (LILBID), en metod utvecklad vid Goethe-universitetet som är speciellt lämpad för analys av stora membranproteinkomplex. En utmaning inom naturlig masspektrometri är att upprätthålla egenskaperna hos proteinerna av intresse, såsom oligomert tillstånd, bundna ligander eller konformationen av proteinkomplexet, under överföringen från lösningen till gasfasen. Detta är en väsentlig förutsättning för att tillåta slutsatser om lösningstillståndsproteinkomplexet, baserat på gasfasmätningarna. Därför krävs mjuka joniseringstekniker. Medan standardmetoder, såsom nESI och matrisassisterad laserdesorption/jonisering (MALDI) på ett tillförlitligt sätt levererar värdefulla resultat för lösliga proteiner, är de inte universellt tillämpliga på de mer utmanande matriserna som ofta krävs för membranproteinkomplex. I allmänhet krävs en artificiell membranmimetisk miljö för att bibehålla ett membranproteinkomplex i dess naturliga tillstånd utanför den cellulära miljön. Med LILBID analyten till masspektrometern i små droppar (30 eller 50 µm diameter) av provlösningen som produceras av en piezodriven droppgenerator och desorberas från den vattenhaltiga lösningen genom bestrålning med en mid-IR-laser. Detta resulterar i biomolekylära joner med lägre, mer naturliga laddningstillstånd i jämförelse med nESI. Vid ultramjuka desorptionsförhållanden förblir även svagt interagerande subenheter av stora proteinkomplex associerade, så att massan av hela komplexet kan bestämmas. Vid högre laserintensiteter dissocieras komplexet genom termolys och subenhetmassor registreras. Ett brett utbud av makromolekylära komplex från CEF-forskningsområdena A, C och D, inklusive komplex I , ATP-syntas , läkemedelstransportörer med bindande proteiner, jonkanaler , proteorhodopsiner och DNA/RNA-komplex, har analyserats med hjälp av LILBID.

Tidsupplöst spektroskopi

Femtosekund tidsupplöst spektroskopi användes av CEF-forskare för att studera molekylär dynamik och funktion. Denna metod möjliggör observation av extremt snabba kemiska och biologiska reaktioner i realtid som involverar en mängd olika molekyler från små organiska föreningar till komplexa enzymer. Studier inkluderade molekylära system som optiska switchar, naturliga och icke-naturliga fotosyntetiska modellsystem och membranproteinkomplex. Grundläggande processer inom molekylär fysikalisk kemi undersöktes, såsom fotoisomerisering, energi- och elektronöverföring och reaktionsdynamik vid ytor. Moderna metoder inom kvantoptik för generering av lämpligt formade och avstämbara femtosekundpulser i det synliga och infraröda spektralområdet användes och vidareutvecklades. Exempel på dessa studier inkluderar undersökningen och dechiffreringen av dynamiken hos fotoväxlingsbara eller fotolabila föreningar som grund för designen av fotoresponsiva biomakromolekyler, av den primära reaktionsdynamiken för kanalrodopsin-2 (ChR2) och av konformationsdynamiken hos antibiotikabindande aptamerer: Fotokromisk spiropyraner är organiska molekyler som kan användas för att utlösa biologiska reaktioner.

Teoretisk biofysik och bioinformatik

Metodutveckling inom teoretisk biofysik spelar en allt viktigare roll i studiet av makromolekylära komplex och har gett väsentliga bidrag till många studier inom andra forskningsområden inom CEF. Som en bro mellan grundläggande fysik, kemi och biologi studerade CEF-forskare biomolekylära processer över ett brett upplösningsområde, från kvantmekanik till kemisk kinetik, från atomistiska beskrivningar av fysikaliska processer och kemiska reaktioner i simuleringar av molekylär dynamik (MD) till mycket grovkorniga modeller av molekylära maskiners icke-jämviktsdrift och nätverksbeskrivningar av proteininteraktioner. Deras mål är att utveckla detaljerade och kvantitativa beskrivningar av viktiga biomolekylära processer, inklusive energiomvandling, molekylär transport, signaltransduktion och enzymatisk katalys. Inom CEF arbetade de i nära samarbete med experimentella forskare som använder en mängd olika metoder. Deras beräkningsmässiga och teoretiska studier hjälpte till med tolkningen av allt mer komplexa mätningar och vägledde utformningen av framtida experiment. Det tvärvetenskapliga området bioinformatik öppnade nya perspektiv på molekylära processer och cellulär funktion. CEF-forskare använde skräddarsydd kod och pipelines för snabb och effektiv analys av omics-data, med ett primärt fokus på protein-RNA-interaktioner och posttranskriptionell reglering. De utvecklar också algoritmer för att lösa problem inom molekylärbiologi, allt från analys av atomproteinstruktur till beräkningssystembiologi. Deras verktyg utnyttjar grafteori, petrinät och booleska nätverk med breda tillämpningar inom CEF. Deras samarbeten täcker olika ämnen från växtmetabolomik, till mänskliga signaltransduktionsnätverk och dissektion av det makromolekylära komplexomet.

Organisation

CEF-församlingen samordnade forskningen och valde CEF-talaren och CEF:s styrelse. CEF-församlingen bestod av huvudutredarna, adjungerade utredare, seniora utredare samt associerade medlemmar. Talare för CEF var Werner Müller-Esterl (nov 2006-jan 2009), Harald Schwalbe (feb 2009 - feb 2013) och Volker Dötsch (mars 2013 - oktober 2019).

Publikationer

CEF-forskare publicerade mer än 2600 originalforskningspublikationer (inkl. 479 forskningsartiklar i tidskrifter med en impact factor på ≥10) under klustrets livstid. En fullständig lista finns här .

Heder och priser tilldelas CEF-forskare

En fullständig lista finns här .

externa länkar


Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cluster_of_Excellence_Frankfurt_Macromolecular_Complexes&oldid=1137214155 "