iCLIP

Ej att förväxla med Intramembrane protease , ibland förkortat I-CLiP.

iCLIP (individual-nucleotide resolution CrossLinking and ImmunoPrecipitation) är en variant av den ursprungliga CLIP-metoden som används för att identifiera protein-RNA-interaktioner, som använder UV-ljus för att kovalent binda proteiner och RNA-molekyler för att identifiera RNA-bindningsställen för proteiner. Detta tvärbindningssteg har i allmänhet mindre bakgrund än standardprotokoll för RNA-immunoutfällning (RIP), eftersom den kovalenta bindningen som bildas av UV-ljus gör att RNA kan fragmenteras, följt av strikt rening, och detta gör det också möjligt för CLIP att identifiera positionerna för protein-RNA-interaktioner. Som med alla CLIP- metoder tillåter iCLIP en mycket stringent rening av de länkade protein-RNA-komplexen genom stringent tvättning under immunoutfällning följt av SDS-PAGE och överföring till nitrocellulosa. De märkta protein-RNA-komplexen visualiseras sedan för kvalitetskontroll, skärs ut från nitrocellulosa och behandlas med proteinas för att frigöra RNA:t, vilket endast lämnar ett fåtal aminosyror vid tvärbindningsstället för RNA:t.

RNA:t transkriberas sedan omvänt, vilket gör att de flesta cDNA:n trunkeras vid tvärbindningsplatsen, och nyckelinnovationen och den unika egenskapen i utvecklingen av iCLIP var att möjliggöra för sådana trunkerade cDNA:er att PCR-amplifieras och sekvenseras med hjälp av en nästa generations sekvenseringsplattform. iCLIP lade också till en slumpmässig sekvens (unik molekylär identifierare, UMI ) tillsammans med experimentella streckkoder till primern som används för omvänd transkription, och streckkodade därigenom unika cDNA för att minimera eventuella fel eller kvantitativa fördomar i PCR, och därmed förbättra kvantifieringen av bindningshändelser. Möjliggörande av amplifiering av trunkerade cDNA ledde till identifiering av platserna för RNA-proteininteraktioner vid hög upplösning genom att analysera startpositionen för trunkerade cDNA, såväl som deras exakta kvantifiering med UMI:er med programvara som kallas "iCount " . Alla dessa innovationer av iCLIP anammades av senare varianter av CLIP som eCLIP och irCLIP. Ett ytterligare tillvägagångssätt för att identifiera protein-RNA-tvärbindningsställen är mutationsanalysen av genomläsnings-cDNA, såsom nukleotidövergångar i PAR-CLIP , eller andra typer av fel som kan introduceras av omvänt transkriptas när det läser igenom tvärbindningsstället i standard HITS-CLIP- metod med CIMS-analys (crosslink-induced mutation site).

Den kvantitativa karaktären hos iCLIP möjliggjorde banbrytande jämförelse mellan prover på nivån av fullständiga RNA, eller för att studera kompetitiv bindning av flera RNA-bindande proteiner eller subtila förändringar i bindning av ett mutant protein vid nivån av bindningstoppar. En förbättrad variant av iCLIP (iiCLIP) utvecklades nyligen för att förbättra effektiviteten och bekvämligheten av cDNA-bibliotekspreparat, till exempel genom att enzymatiskt avlägsna adaptern efter ligering för att minimera artefakter orsakade av adapteröverföring, vilket introducerar den icke-radioaktiva visualiseringen av proteinet- RNA-komplex (som ursprungligen gjordes av irCLIP), ökar effektiviteten av ligering, proteinas och omvänd transkriptionsreaktioner, och möjliggör pärlbaserad rening av cDNA.

Analys av CLIP-sekvenseringsdata drar nytta av användningen av skräddarsydd beräkningsprogramvara, varav mycket är tillgänglig som en del av Nextflow-pipelinen för CLIP-analys, och specialiserad programvara är tillgänglig för snabb demultiplexering av komplexa multiplexerade bibliotek, jämförande visualisering av tvärbindningsprofiler över RNA, identifiering av topparna av klustrade protein-RNA-tvärbindningsställen och identifiering av sekvensmotiv berikade runt framträdande tvärbindningar. Dessutom iMaps en gratis webbplattform för CLIP-analys och välutvecklad communitydatabas för att underlätta studier av RNA-reglerande nätverk över organismer, med en backend baserad på Nextflow-pipeline. Det är tillämpligt på de många variantprotokollen av CLIP (såsom iCLIP, eCLIP, etc), och kan användas för att analysera opublicerade data på ett säkert sätt, eller för att erhålla offentliga CLIP-data i ett välkommenterat format, tillsammans med olika former av kvalitetskontroll, visualisering och jämförelse. Frågor om experimentella och beräkningsmässiga utmaningar samlas på Q&A CLIP Forum .