Elektron kryotomografi
Elektronkryotomografi ( CryoET ) är en avbildningsteknik som används för att producera högupplösta (~1–4 nm) tredimensionella vyer av prover, ofta (men inte begränsat till) biologiska makromolekyler och celler . CryoET är en specialiserad tillämpning av transmissionselektronkryomikroskopi (CryoTEM) där prover avbildas när de lutar, vilket resulterar i en serie 2D-bilder som kan kombineras för att producera en 3D-rekonstruktion, liknande en CT-skanning av människokroppen. I motsats till andra elektrontomografitekniker avbildas prover under kryogena förhållanden (< -150 °C). För cellulärt material är strukturen immobiliserad i icke-kristallin glasaktig is, vilket gör att de kan avbildas utan uttorkning eller kemisk fixering, vilket annars skulle störa eller förvränga biologiska strukturer.
Beskrivning av teknik
I elektronmikroskopi (EM) avbildas prover i högvakuum. Ett sådant vakuum är oförenligt med biologiska prover såsom celler; vattnet skulle koka av, och tryckskillnaden skulle explodera cellen. I rumstemperatur EM-tekniker förbereds därför prover genom fixering och dehydrering. Ett annat tillvägagångssätt för att stabilisera biologiska prover är dock att frysa dem ( elektronkryomikroskopi) . Som i andra elektronkryomikroskopitekniker förbereds prover för CryoET (vanligtvis små celler som bakterier , Archaea eller virus ) i standardvattenhaltiga medier och appliceras på ett EM-nät. Gallret kastas sedan ner i en kryogen (typiskt flytande etan ) så effektivt att vattenmolekyler inte hinner omordnas till ett kristallint gitter . Det resulterande vattentillståndet kallas "glasaktig is" och bevarar inhemska cellulära strukturer, såsom lipidmembran, som normalt skulle förstöras vid frysning. Dykfrysta prover lagras därefter och avbildas vid flytande kvävetemperaturer så att vattnet aldrig värms tillräckligt för att kristallisera.
Prover avbildas i ett transmissionselektronmikroskop (TEM). Som i andra elektrontomografitekniker lutar provet till olika vinklar i förhållande till elektronstrålen (vanligtvis var 1 eller 2 grader från cirka -60° till +60°), och en bild förvärvas vid varje vinkel. Denna tilt-serie av bilder kan sedan beräkningsmässigt rekonstrueras till en tredimensionell vy av föremålet av intresse. Detta kallas ett tomogram, eller tomografisk rekonstruktion.
Ansökningar
I transmissionselektronmikroskopi (TEM), eftersom elektroner interagerar starkt med materia, begränsas upplösningen av provets tjocklek. Även tjockleken på provet ökar när provet lutar, och tjockare prover kan då helt blockera elektronstrålen, vilket gör bilden mörk eller helt svart. Därför, för CryoET, bör proverna vara mindre än ~500 nm tjocka för att uppnå "makromolekylär" upplösning (~4 nm). Av denna anledning har de flesta ECT-studier fokuserat på renade makromolekylära komplex, virus eller små celler, såsom de från många arter av bakterier och Archaea. Kryotomografi användes för att förstå inkapsling av 12 nm storlek proteinbur nanopartiklar inuti 60 nm stora virusliknande nanopartiklar.
Större celler, och till och med vävnader, kan förberedas för CryoET genom uttunning, antingen genom kryosnitt eller genom fräsning med fokuserad jonstråle (FIB). Vid kryosektion sektioneras frusna block av celler eller vävnad i tunna prover med en kryomikrotom . Vid FIB-fräsning exponeras dykfrysta prover för en fokuserad stråle av joner, typiskt gallium, som exakt skär bort material från toppen och botten av ett prov, vilket lämnar en tunn lamell som är lämplig för ECT-avbildning.
Den starka interaktionen mellan elektroner och materia resulterar också i en anisotrop upplösningseffekt. När provet lutar under avbildning interagerar elektronstrålen med en relativt större tvärsnittsarea vid högre lutningsvinklar. I praktiken ger lutningsvinklar större än cirka 60–70° inte mycket information och används därför inte. Detta resulterar i en "saknad kil" av information i det slutliga tomogrammet som minskar upplösningen parallellt med elektronstrålen.
För strukturer som finns i flera kopior i ett eller flera tomogram, kan högre upplösning (även ≤1 nm) erhållas genom subtomogrammedelvärde. I likhet med analys av en enskild partikel kombinerar subtomogrammedelvärdesberäkning bilder av identiska objekt för att öka signal-brusförhållandet .
Ett stort hinder i CryoET är att identifiera strukturer av intresse inom komplicerade cellulära miljöer. En lösning är att tillämpa korrelerad kryofluorescensljusmikroskopi och till och med superupplösningsljusmikroskopi (t.ex. cryo-PALM) och CryoET. I dessa tekniker, är ett prov som innehåller ett fluorescensmärkt protein av intresse dykfrysas och först avbildas i ett ljusmikroskop utrustat med ett specialsteg för att tillåta provet att hållas vid subkristallisationstemperaturer (< -150 °C). Placeringen av den fluorescerande signalen identifieras och provet överförs till CryoTEM, där samma plats sedan avbildas med hög upplösning av CryoET.
Se även
- Elektronmikroskopi
- Elektrontomografi
- Transmissionselektronkryomikroskopi
- Transmissionselektronmikroskopi