Ljusark fluorescensmikroskopi

Den principiella uppsättningen av ett ljusarksfluorescensmikroskop.

Light sheet fluorescence microscopy ( LSFM ) är en fluorescensmikroskopiteknik med en medelhög till hög optisk upplösning , men goda optiska sektionsförmåga och hög hastighet. I motsats till epifluorescensmikroskopi är endast en tunn skiva (vanligtvis några hundra nanometer till några mikrometer) av provet belyst vinkelrätt mot observationsriktningen. För belysning används en laserljusskiva , dvs en laserstråle som fokuseras endast i en riktning (t.ex. med en cylindrisk lins). En andra metod använder en cirkulär stråle som skannas i en riktning för att skapa ljusarket. Eftersom endast den faktiskt observerade sektionen är upplyst, minskar denna metod fotoskadan och stressen som induceras på ett levande prov. Även den goda optiska sektionsförmågan minskar bakgrundssignalen och skapar därmed bilder med högre kontrast, jämförbar med konfokalmikroskopi . Eftersom ljusarksfluorescensmikroskopi skannar prover genom att använda ett ljusplan istället för en punkt (som i konfokalmikroskopi), kan den ta bilder med hastigheter 100 till 1 000 gånger snabbare än de som erbjuds av punktskanningsmetoder.

Jämförelse av olika mikroskopibelysningsmodaliteter (LSFM: ljusarksfluorescensmikroskopi, WF: widefield-mikroskopi, CF: konfokalmikroskopi). Ljusarkfluorescensmikroskopi kombinerar bra z-sektionering (som konfokal) och belyser endast det observerade planet

Denna metod används inom cellbiologi och för mikroskopering av intakta, ofta kemiskt rensade, organ, embryon och organismer.

Från och med 1994 utvecklades ljusarksfluorescensmikroskopi som ortogonal plan fluorescens optisk sektionsmikroskopi eller tomografi (OPFOS) främst för stora prover och senare som selektiv/enplansbelysningsmikroskopi (SPIM) också med subcellulär upplösning. Detta introducerade ett belysningsschema i fluorescensmikroskopi, som redan har använts framgångsrikt för mörkfältsmikroskopi under namnet ultramikroskopi .

Inställning av ljusarksfluorescensmikroskopi

Grundläggande inställning

Illustration av olika implementeringar av fluorescensmikroskop för ljusark. Se text för detaljer. Förklaring: CAM=kamera, TL=rörlins, F=filter, DO=detektionsobjektiv, S=prov, SC=provkammare, PO=projektionsobjektiv, CL=cylindrisk lins, SM=scanningsspegel

I denna typ av mikroskopi görs belysningen vinkelrätt mot observationsriktningen (se schematisk bild överst i artikeln). Den expanderade strålen från en laser fokuseras i endast en riktning av en cylindrisk lins, eller av en kombination av en cylindrisk lins och ett mikroskopobjektiv eftersom det senare är tillgängligt i bättre optisk kvalitet och med högre numerisk bländare än den första. På så sätt skapas ett tunt ljusark eller ljusark i fokalområdet som kan användas för att excitera fluorescens endast i en tunn skiva (vanligtvis några mikrometer tunn) av provet.

Fluorescensljuset som emitteras från ljusarket samlas sedan in vinkelrätt med ett standardmikroskopobjektiv och projiceras på en bildsensor (vanligtvis en CCD , elektronmultiplicerande CCD eller CMOS - kamera ). För att ge tillräckligt med utrymme för excitationsoptiken/ljusskivan används ett observationsobjektiv med högt arbetsavstånd. I de flesta ljusarksfluorescensmikroskop är detektionsobjektivet och ibland även excitationsobjektivet helt nedsänkta i provbufferten, så vanligtvis är provet och excitations-/detektionsoptiken inbäddade i en buffertfylld provkammare, som också kan användas för att kontrollera miljöförhållanden (temperatur, koldioxidnivå ...) under mätningen. Provmonteringen i ljusarksfluorescensmikroskopi beskrivs mer i detalj nedan.

Eftersom både excitationsljusarket och fokalplanet för detekteringsoptiken måste sammanfalla för att bilda en bild, kan fokusering av olika delar av provet inte göras genom att förvandla detektionsobjektivet, utan vanligtvis översätts och roteras hela provet istället.

Förlängningar av den grundläggande ljusplåtsfluorescensmikroskopidén

Under de senaste åren har flera tillägg till detta system utvecklats:

  • Användningen av två mot-propagerande ljusark hjälper till att minska typiska selektiva planbelysningsmikroskopiartefakter, som skuggning (se första z-stacken ovan)
  • Utöver motförökande ljusark har en uppsättning med detektering från två motsatta sidor föreslagits 2012. Detta möjliggör mätning av z- och rotationsstackar för en fullständig 3D-rekonstruktion av provet snabbare.
  • Ljusarket kan också skapas genom att skanna ett normalt laserfokus upp och ner. Detta tillåter också användning av självrekonstruerande strålar (såsom bessel-strålar eller luftiga strålar ) för belysningen som förbättrar ljusskivans penetration i tjocka prover, eftersom den negativa effekten av spridning på ljusskivan reduceras. Dessa självrekonstruerande strålar kan modifieras för att motverka intensitetsförluster genom att använda dämpningskompensationstekniker, vilket ytterligare ökar signalen som samlas in från tjocka prover.
  • I oblique plane microscopy (OPM) används detektionsobjektivet för att också skapa ljusskivan: Ljusskivan sänds nu ut från detta objektiv under en vinkel på cirka 60°. Ytterligare optik används för att även luta fokalplanet som används för detektering med samma vinkel.
  • Ljusarksfluorescensmikroskopi har också kombinerats med två-foton (2P) excitation , vilket förbättrar penetrationen i tjocka och spridande prover. Användning av 2P-excitation i nära-infraröda våglängder har använts för att ersätta 1P-excitation i blå-synliga våglängder i hjärnavbildningsexperiment som involverar svar på visuella stimuli.
  • Selektiv planbelysningsmikroskopi kan också kombineras med tekniker som fluorescenskorrelationsspektroskopi , för att möjliggöra rumsligt upplösta rörlighetsmätningar av fluorescerande partiklar (t.ex. fluorescerande pärlor, kvantprickar eller fluorescensmärkta proteiner) inuti levande biologiska prover.
  • En kombination av ett selektivt planbelysningsmikroskop med en gated bildförstärkarkamera har också rapporterats som gjorde det möjligt att mäta en karta över fluorescenslivslängder ( fluorescenslivstidsavbildning , FLIM).
  • Ljusarkfluorescensmikroskopi kombinerades med superupplösningsmikroskopitekniker för att förbättra dess upplösning bortom Abbe-gränsen. Även en kombination av stimulerad emissionsutarmningsmikroskopi (STED) och selektiv planbelysningsmikroskopi har publicerats, vilket leder till en minskad ljusarktjocklek på grund av den stimulerade emissionsutarmningsmikroskopieffekten. Se även avsnittet om kraften i upplösning av ljusarksfluorescensmikroskopi nedan.
  • Ljusarksfluorescensmikroskopi modifierades för att vara kompatibel med alla mål, även täckglasbaserade, oljedoppande mål med hög numerisk apertur för att öka den naturliga rumsliga upplösningen och effektiviteten för fluorescensdetektering. Denna teknik involverar lutning av ljusskivan i förhållande till detektionsobjektivet i en exakt vinkel för att tillåta ljusskivan att bildas på ytan av glastäckglas.
  • Ljusarksfluorescensmikroskopi kombinerades med Adaptive Optics -tekniker 2012 för att förbättra bilddjupet i tjocka och inhomogena prover på ett djup av 350 um. En Shack Hartmann vågfrontssensor placerades i detektionsbanan och ledstjärnor används i en nära återkopplingsslinga. I sin avhandling diskuterar författaren fördelen med att ha adaptiv optik både i belysnings- och detekteringsvägen för ljusarkets fluorescensmikroskop för att korrigera aberrationer som induceras av provet.

Provmontering

Olika typer av provmontering för ljusarksfluorescensmikroskopi: embryo inbäddat i hängande gelcylinder, växtodling i understödd gelcylinder, vidhäftande celler på glas, vätskeprov i en provpåse

Separationen av belysnings- och detekteringsstrålbanorna i ljusarksfluorescensmikroskopi (förutom i snedplansmikroskopi ) skapar ett behov av specialiserade provmonteringsmetoder. Hittills är de flesta fluorescensmikroskop för ljusark byggda på ett sådant sätt att belysnings- och detekteringsstrålevägen ligger i ett horisontellt plan (se illustrationerna ovan), så provet hänger vanligtvis uppifrån och in i provkammaren eller vilar på ett vertikalt stöd inuti provkammaren. Flera metoder har utvecklats för att montera alla typer av prover:

  • Fasta (och eventuellt även rensade) prover kan limmas på ett enkelt stöd eller hållare och kan stanna kvar i fixeringslösningen under avbildning.
  • Större levande organismer sederas vanligtvis och monteras i en mjuk gelcylinder som extruderas från en (glas eller plast) kapillär som hänger uppifrån in i provkammaren.
  • Vidhäftande celler kan odlas på små glasplattor som hänger i provkammaren.
  • Växter kan odlas i klara geler som innehåller ett odlingsmedium. Gelerna skärs bort vid avbildningspositionen, så de minskar inte ljusskivan och bildkvaliteten genom spridning och absorption.
  • Vätskeprover (t.ex. för fluorescenskorrelationsspektroskopi ) kan monteras i små påsar gjorda av tunn plastfolie som matchar brytningsindexet för det omgivande nedsänkningsmediet i provkammaren.

Vissa fluorescensmikroskop för ljusark har utvecklats där provet är monterat som i standardmikroskopi (t.ex. celler växer horisontellt på botten av en petriskål ) och excitations- och detektionsoptiken är konstruerade i ett upprättstående plan ovanifrån. Detta gör det också möjligt att kombinera ett fluorescensmikroskop med lätta ark med ett standardmikroskop med omvänd vinkel och undviker kravet på specialiserade provmonteringsprocedurer.

Ljusark fluorescensmikroskopi bildegenskaper

Typiska bildlägen

De flesta ljusarkfluorescensmikroskop används för att producera 3D-bilder av provet genom att flytta provet genom bildplanet. Om provet är större än bildsensorns synfält måste provet också förskjutas i sidled. Ett alternativt tillvägagångssätt är att flytta bildplanet genom provet för att skapa bildstapeln.

Långa experiment kan utföras, till exempel med stackar som registreras var 10:e sek–10 min under en tidsperiod av dagar. Detta möjliggör studier av förändringar över tid i 3D, eller så kallad 4D-mikroskopi.

Efter bildinsamlingen registreras de olika bildstackarna för att bilda en enda 3D-datauppsättning. Flera vyer av provet kan samlas in, antingen genom att byta roller för målen eller genom att rotera provet. Att ha flera vyer kan ge mer information än en enda stack; till exempel kan ocklusion av vissa delar av provet övervinnas. Flera vyer förbättrar också 3D-bildupplösningen genom att övervinna dålig axiell upplösning som beskrivs nedan.

Vissa studier använder också ett selektivt planbelysningsmikroskop för att avbilda endast en bit av provet, men med mycket högre tidsupplösning. Detta tillåter t.ex. att observera det bankande hjärtat hos ett zebrafiskembryo i realtid. Tillsammans med snabba översättningssteg för provet har en höghastighets 3D-partikelspårning implementerats.

Upplösningskraft

Den laterala upplösningen för ett selektivt plan belysningsmikroskop är jämförbar med den för ett standard (epi) fluorescensmikroskop, eftersom den bestäms helt av detektionsmålet och våglängden för det detekterade ljuset (se Abbe limit ) . Till exempel för detektion i det gröna spektralområdet runt 525 nm kan en upplösning på 250–500 nm uppnås. Den axiella upplösningen är sämre än den laterala (ungefär en faktor 4), men den kan förbättras genom att använda en tunnare ljusskiva i vilket fall nästan isotrop upplösning är möjlig. Tunnare ljusskivor är antingen tunna endast i ett litet område (för gaussiska strålar ) eller så måste specialiserade strålprofiler som Bessel-strålar användas (förutom ökad komplexitet lägger sådana system till sidolober som kan vara skadliga). Alternativt kan isotrop upplösning uppnås genom att beräkningsmässigt kombinera 3D-bildstaplar tagna från samma prov under olika vinklar. Sedan tillförs djupupplösningsinformationen som saknas i en stack från en annan stack; till exempel med två ortogonala staplar är den (dålig upplösning) axiella riktningen i en stapel en (högupplöst) lateral riktning i den andra stapeln.

Den laterala upplösningen av ljusarksfluorescensmikroskopi kan förbättras bortom Abbe-gränsen, genom att använda superupplösningsmikroskopitekniker , t.ex. genom att använda det faktum att enskilda fluoroforer kan lokaliseras med mycket högre rumslig precision än den nominella upplösningen för det använda optiska systemet ( se tekniker för stokastisk lokaliseringsmikroskopi) . I Structured Illumination Light Sheet Microscopy har strukturerade belysningstekniker använts för att ytterligare förbättra den optiska sektioneringskapaciteten för ljusarksfluorescensmikroskopi.

Stripe artefakter

Överst: randartefakter i ljusarksfluorescensmikroskopi. Nederst: Minska randartefakter genom att vrida

Eftersom belysningen vanligtvis penetrerar provet från ena sidan, kan hinder som ligger i vägen för ljusskivan störa dess kvalitet genom att sprida och/eller absorbera ljuset. Detta leder vanligtvis till mörka och ljusa ränder i bilderna. Om delar av proverna har ett betydligt högre brytningsindex (t.ex. lipidvesiklar i celler) kan de också leda till en fokuseringseffekt som resulterar i ljusa ränder bakom dessa strukturer. För att övervinna denna artefakt kan ljusskivorna t.ex. vara "svängbara". Det betyder att ljusskivans infallsriktning ändras snabbt (~1 kHz-hastighet) med några grader (~10°), så ljuset träffar också områdena bakom hindren. Belysning kan också utföras med två (svängda) ljusark (se ovan) för att ytterligare reducera dessa artefakter. Alternativt har Variational Stationary Noise Remover (VSNR)-algoritmen utvecklats och är tillgänglig som ett gratis Fiji-plugin.

Historia

I början av 1900-talet introducerade RA Zsigmondy ultramikroskopet som ett nytt belysningssystem i mörkfältsmikroskopi. Här används solljus eller en vit lampa för att belysa en precisionsslits. Slitsen avbildas sedan av en kondensorlins i provet för att bilda ett ljusark. Spridning (sub-diffraktiva) partiklar kan observeras vinkelrätt med ett mikroskop. Denna uppställning möjliggjorde observation av partiklar med storlekar mindre än mikroskopets upplösning och ledde till ett Nobelpris för Zsigmondy 1925.

Den första tillämpningen av detta belysningsschema för fluorescensmikroskopi publicerades 1993 av Voie et al. under namnet ortogonal-plane fluorescence optical sectioning (OPFOS). för avbildning av snäckans inre struktur . Upplösningen vid den tiden var begränsad till 10 µm i sidled och 26 µm i längdriktningen men vid en provstorlek i millimeterområdet. Det ortogonala plana fluorescensoptiska sektionsmikroskopet använde en enkel cylindrisk lins för belysning. Ytterligare utveckling och förbättring av det selektiva planbelysningsmikroskopet startade 2004. Efter denna publikation av Huisken et al. Tekniken fick bred tillämpning och är fortfarande anpassad till nya mätsituationer idag (se ovan). Sedan 2010 är ett första ultramikroskop med fluorescensexcitation och begränsad upplösning och sedan 2012 ett första selektivt planbelysningsmikroskop tillgängliga kommersiellt. En bra översikt över utvecklingen av selektiv planbelysningsmikroskopi ges i ref. Under 2012 har det också börjat dyka upp projekt med öppen källkod som fritt publicerar kompletta konstruktionsplaner för fluorescensmikroskop för ljusark och även nödvändiga programvarupaket.

Ansökningar

Selektiv planbelysningsmikroskopi/ljusarksfluorescensmikroskopi används ofta inom utvecklingsbiologin, där den möjliggör långtidsobservationer (flera dagar) av embryonal utveckling (även med rekonstruktion av hela härstamningsträd). Selektiv plan belysningsmikroskopi kan också kombineras med tekniker, som fluorescenskorrelationsspektroskopi för att möjliggöra rumsligt upplösta rörlighetsmätningar av fluorescerande partiklar (t.ex. fluorescerande pärlor, kvantprickar eller fluorescerande proteiner) inuti levande biologiska prover.

Starkt spridande biologisk vävnad som hjärna eller njure måste fixeras kemiskt och rensas innan den kan avbildas i ett selektivt planbelysningsmikroskop. Särskilda vävnadsrensningstekniker har utvecklats för detta ändamål, t.ex. 3DISCO , CUBIC och CLARITY . Beroende på brytningsindexet för det rensade provet måste matchande nedsänkningsvätskor och speciella långdistansobjektiv användas under avbildning.

  • Selektiv planbelysningsmikroskopi avbildning av en levande sfäroid som uttrycker H2B-HcRed. Z-stackar av 100 skivor med skivavstånd på 1 μm registrerades var tredje minut (10x objektiv, NA = 0,3). Den maximala projiceringen av z-stackarna visas för varje tidpunkt.

  • Bilder av fritt rörliga DiI-märkta amöbor, erhållna med ezDSLM.

  • HeLa-celler som uttrycker tetramerer av det grönt fluorescerande proteinet . Till vänster visas en bild med transmissionsbelysning och på höger sida en bild av fluorescensmikroskop av ljusark. Typiska artefakter för selektiv planbelysningsmikroskopi, såsom skuggor, kan ses tydligt. Ljusarket var riktat från botten till toppen.

  • Volumetrisk rekonstruktion av z-stacken i bilden ovan.

  • A mouse brain (Thy-1 GFP-M) cleared using 3DISCO method and imaged by light-sheet microscopy.

    En mushjärna (Thy-1 GFP-M) rensades med 3DISCO- metoden och avbildades med ljusarkmikroskopi.

Vidare läsning

externa länkar

  • på YouTube : Den länkade videon visar utvecklingen av ett fruktflugembryo, som spelades in under 20 timmar. Två projektioner av hela 3D-dataset visas.
  • MesoSPIM-initiativet. Ljusarkmikroskop med öppen källkod för avbildning av rensad vävnad.
Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Light_sheet_fluorescence_microscopy&oldid=1140005694 "