Gen knockout

Gen-knockouts (även känd som gendeletion eller geninaktivering) är en allmänt använd genteknikteknik som involverar riktat avlägsnande eller inaktivering av en specifik gen i en organisms genom. Detta kan göras genom en mängd olika metoder, inklusive homolog rekombination , CRISPR-Cas9 och TALENs .

En av de främsta fördelarna med gen-knockouts är att de tillåter forskare att studera funktionen av en specifik gen in vivo och att förstå genens roll i normal utveckling och fysiologi såväl som i sjukdomars patologi. Genom att studera fenotypen av organismen med den utslagna genen kan forskare få insikter i de biologiska processer som genen är inblandad i.

Det finns två huvudtyper av genknockout: fullständig och villkorlig. En komplett genknockout inaktiverar genen permanent, medan en villkorad genknockout gör att genen kan stängas av och slås på vid specifika tidpunkter eller i specifika vävnader. Villkorliga knockouts är särskilt användbara för att studera utvecklingsprocesser och för att förstå rollen av en gen i specifika celltyper eller vävnader.

Gen knockouts har använts i stor utsträckning i många olika organismer, inklusive bakterier, jäst, fruktflugor, zebrafiskar och möss. Hos möss används genknockouts ofta för att studera funktionen hos specifika gener inom utveckling, fysiologi och cancerforskning.

Användningen av genknockouts i musmodeller har varit särskilt värdefull i studien av mänskliga sjukdomar. Till exempel har genknockouts hos möss använts för att studera rollen av specifika gener i cancer, neurologiska störningar, immunförsvar och metabola störningar.

Men genknockouts har också vissa begränsningar. Till exempel kanske förlusten av en enskild gen inte helt efterliknar effekterna av en genetisk störning, och knockouterna kan ha oavsiktliga effekter på andra gener eller vägar. Dessutom är genknockout inte alltid en bra modell för mänskliga sjukdomar eftersom musgenomet inte är identiskt med det mänskliga genomet, och musfysiologi skiljer sig från mänsklig psykiatri.

KO-tekniken är i huvudsak motsatsen till en gen-knock-in . Att slå ut två gener samtidigt i en organism är känt som en dubbel knockout ( DKO ). På liknande sätt används termerna trippel knockout ( TKO ) och fyrdubbla knockouts ( QKO ) för att beskriva tre respektive fyra knockout-gener. Man måste dock skilja mellan heterozygota och homozygota KOs. I den förra är endast en av två genkopior ( alleler ) utslagen, i den senare är båda utslagna.

Metoder

Knockouts åstadkoms genom en mängd olika tekniker. Ursprungligen naturligt förekommande mutationer och sedan måste genförlust eller inaktivering fastställas genom DNA-sekvensering eller andra metoder.

En laboratoriemus där en gen som påverkar hårväxten har slagits ut (till vänster), visas bredvid en vanlig labbmus.

Gen knockout genom mutation

Gen knockout genom mutation utförs vanligtvis i bakterier. Ett tidigt exempel på användningen av denna teknik i Escherichia coli publicerades 1989 av Hamilton, et al. I detta experiment användes två sekventiella rekombinationer för att ta bort genen. Detta arbete etablerade möjligheten att ta bort eller ersätta en funktionell gen i bakterier. Den metoden har sedan dess utvecklats för andra organismer, särskilt forskningsdjur, som möss. Knockout-möss används ofta för att studera gener med mänskliga motsvarigheter som kan ha betydelse för sjukdomar. Ett färskt exempel på en studie med knockoutmöss är en undersökning av Xirp-proteiners roller i Sudden Unexplained Nocturnal Death Syndrome (SUNDS) och Brugada-syndrom i den kinesiska Han-populationen av Cheng, et al.

Gen tystande

För gen-knockout-undersökningar har RNA-interferens (RNAi), en nyare metod, även känd som gentystnad, blivit populär. Vid RNA-interferens (RNAi) inaktiveras budbärar-RNA för en viss gen med hjälp av litet störande RNA (siRNA) eller kort hårnåls-RNA (shRNA). Detta stoppar effektivt genen från att uttryckas. Onkogener som Bcl-2 och p53, såväl som gener kopplade till neurologiska sjukdomar, genetiska störningar och virusinfektioner, har alla varit inriktade på gentystnad med användning av RNA-interferens (RNAi).

Homolog rekombination

Homolog rekombination är utbytet av gener mellan två DNA-strängar som inkluderar omfattande regioner av bassekvenser som är identiska med varandra. Hos eukaryota arter, bakterier och vissa virus sker homolog rekombination spontant och är ett användbart verktyg för genmanipulation. Homolog rekombination, som äger rum under meios i eukaryoter, är väsentlig för reparation av dubbelsträngade DNA-brott och främjar genetisk variation genom att tillåta förflyttning av genetisk information under kromosomal korsning. Homolog rekombination, en nyckelmekanism för DNA-reparation i bakterier, möjliggör införande av genetiskt material som förvärvats genom horisontell överföring av gener och transformation till DNA. Homolog rekombination i virus påverkar förloppet av viral utveckling. Homolog rekombination, en typ av geninriktning som används inom genteknik, involverar införandet av en konstruerad mutation i en viss gen för att lära sig mer om genens funktion. Denna metod innebär att man infogar främmande DNA i en cell som har en sekvens som liknar målgenen samtidigt som den flankeras av sekvenser som är samma uppströms och nedströms om målgenen. Målgenens DNA ersätts med den främmande DNA-sekvensen under replikering när cellen detekterar liknande flankerande regioner som homologer. Målgenen "slås ut" av utbytet. Genom att använda denna teknik för att rikta in sig på särskilda alleler i embryonala stamceller hos möss är det möjligt att skapa knockout-möss. Med hjälp av geninriktning har många musgener stängts av, vilket leder till skapandet av hundratals distinkta musmodeller av olika mänskliga sjukdomar, såsom cancer, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar och neurologiska störningar. Mario Capecchi, Sir Martin J. Evans och Oliver Smithies utförde banbrytande forskning om homolog rekombination i musstamceller, och de delade 2007 års Nobelpris i fysiologi eller medicin för sina resultat.

Traditionellt var homolog rekombination den huvudsakliga metoden för att orsaka en genknockout. Denna metod innefattar att skapa en DNA-konstruktion som innehåller den önskade mutationen. För knockout-ändamål involverar detta vanligtvis en läkemedelsresistensmarkör i stället för den önskade knockout-genen. Konstruktionen kommer också att innehålla minst 2 kb homologi med målsekvensen. Konstruktionen kan levereras till stamceller antingen genom mikroinjektion eller elektroporering . Denna metod förlitar sig sedan på cellens egna reparationsmekanismer för att rekombinera DNA-konstruktionen till det befintliga DNA:t. Detta resulterar i att gensekvensen förändras, och i de flesta fall kommer genen att översättas till ett icke-funktionellt protein , om det överhuvudtaget översätts. Detta är emellertid en ineffektiv process, eftersom homolog rekombination endast står för 10-2 ^till 10-3 ^av DNA-integreringarna. Ofta används läkemedelsselektionsmarkören på konstruktionen för att selektera celler i vilka rekombinationshändelsen har inträffat.

Vildtyp Physcomitrella och knockoutmossor : Avvikande fenotyper inducerade i genstörande bibliotekstransformanter. Physcomitrella vildtyp och transformerade växter odlades på minimalt Knop-medium för att inducera differentiering och utveckling av gametoforer . För varje anläggning visas en översikt (övre raden; skalstreck motsvarar 1 mm) och en närbild (nedre raden; skalstreck motsvarar 0,5 mm). S: Haploid mossväxt av vildtyp helt täckt med lummiga gametoforer och närbild av vildtypsblad. B–D: Olika mutanter.

Dessa stamceller som nu saknar genen kan användas in vivo , till exempel i möss, genom att infoga dem i tidiga embryon. Om den resulterande chimära musen innehöll den genetiska förändringen i deras könslinje, kunde denna sedan överföras till avkommor.

I diploida organismer, som innehåller två alleler för de flesta gener, och som lika gärna kan innehålla flera relaterade gener som samarbetar i samma roll, utförs ytterligare omgångar av transformation och selektion tills varje målgenen är utslagen. Selektiv avel kan krävas för att producera homozygota knockoutdjur.

Platsspecifika nukleaser

Fig 1. Frameshift-mutation som är ett resultat av en enstaka baspar deletion, vilket orsakar förändrad aminosyrasekvens och för tidigt stoppkodon.

Det finns för närvarande tre metoder som används som innebär att man riktar in en DNA-sekvens exakt för att införa ett dubbelsträngat brott. När detta inträffar, kommer cellens reparationsmekanismer att försöka reparera detta dubbelsträngade brott, ofta genom icke-homolog ändsammanfogning (NHEJ), vilket innebär att direkt ligera de två avskurna ändarna tillsammans. Detta kan göras ofullständigt och kan därför ibland orsaka insättningar eller deletioner av baspar, vilket orsakar ramskiftningsmutationer . Dessa mutationer kan göra genen i vilken de förekommer icke-funktionell, vilket skapar en knockout av den genen. Denna process är mer effektiv än homolog rekombination och kan därför lättare användas för att skapa bialleliska knockouts.

Zink-fingrar

Zinkfingernukleaser består av DNA-bindande domäner som exakt kan rikta in sig på en DNA-sekvens. Varje zinkfinger kan känna igen kodon för en önskad DNA-sekvens och kan därför sättas ihop modulärt för att binda till en viss sekvens. Dessa bindningsdomäner är kopplade med ett restriktionsendonukleas som kan orsaka ett dubbelsträngat brott (DSB) i DNA:t. Reparationsprocesser kan introducera mutationer som förstör funktionaliteten hos genen.

TALENS

Transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser ( TALENs ) innehåller också en DNA-bindande domän och ett nukleas som kan klyva DNA. Den DNA-bindande regionen består av aminosyrarepetitioner som var och en känner igen ett enda baspar av den önskade mål-DNA-sekvensen. Om denna klyvning är riktad mot en genkodande region, och NHEJ-medierad reparation introducerar insättningar och deletioner, uppstår ofta en ramförskjutningsmutation, vilket stör genens funktion.

CRISPR/Cas9

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) är en genteknik som möjliggör exakt redigering av genomet. En tillämpning av CRISPR är gen-knock-out, vilket innebär att inaktivera eller "slå ut" en specifik gen i en organism.

Processen för gen-knock-out med CRISPR involverar tre huvudsteg: design av ett guide-RNA (gRNA) som riktar sig mot en specifik plats i genomet, levererar gRNA och ett Cas9-enzym (som fungerar som en molekylär sax) till målcellen, och sedan låta cellen reparera snittet i DNA:t. När cellen reparerar snittet kan den antingen sammanfoga snittändarna igen, vilket resulterar i en icke-funktionell gen, eller introducera en mutation som stör genens funktion.

Denna teknik kan användas i en mängd olika organismer, inklusive bakterier, jäst, växter och djur, och den tillåter forskare att studera funktionen hos specifika gener genom att observera effekterna av deras frånvaro. CRISPR-baserad gen-knock-out är ett kraftfullt verktyg för att förstå sjukdomens genetiska grund och för att utveckla nya terapier.

Det är viktigt att notera att CRISPR-baserad gen-knock-out, liksom all genteknik, har potential att ge oavsiktliga eller skadliga effekter på organismen, så den bör användas med försiktighet. Den kopplade Cas9 kommer att orsaka ett dubbelsträngat brott i DNA:t. Enligt samma princip som zinkfingrar och TALENs, resulterar försöken att reparera dessa dubbelsträngade brott ofta i ramskiftningsmutationer som resulterar i en icke-funktionell gen.

Knockin

Gen knockin liknar gen knockout, men den ersätter en gen med en annan istället för att radera den.

Typer

Villkorliga knockouts

En villkorad genknockout tillåter gendeletion i en vävnad på ett vävnadsspecifikt sätt. Detta krävs i stället för en genknockout om nollmutationen skulle leda till embryonal död , eller om en specifik vävnad eller celltyp är av specifikt intresse. Detta görs genom att introducera korta sekvenser som kallas loxP-ställen runt genen. Dessa sekvenser kommer att introduceras i könslinjen via samma mekanism som en knock-out. Denna könslinje kan sedan korsas till en annan könslinje som innehåller Cre-rekombinas som är ett viralt enzym som kan känna igen dessa sekvenser, rekombinerar dem och raderar genen som flankeras av dessa platser.

Gener som inte är involverade i tidig utveckling har effektivt studerats med hjälp av knockout-metoder som använder gendeletion. Det är dock vanligtvis inte möjligt att slå av gener som är aktiva under tidig utveckling utan att organismen drabbas av dödlig utgång. En metod kring detta är villkorlig knockout. Genom att använda ett platsspecifikt rekombinas som kallas Cre, rekombinerade den ursprungliga villkorade knockout-tekniken korta målsekvenser kända som LoxP. Sedan dess har andra rekombinaser skapats och använts i villkorliga knockout-experiment.

Använda sig av

En knockout-mus (vänster) som är en modell av fetma jämfört med en vanlig mus.

Knockouts används främst för att förstå rollen för en specifik gen eller DNA- region genom att jämföra knockout -organismen med en vildtyp med liknande genetisk bakgrund.

Knockout- organismer används också som screeningverktyg i utvecklingen av läkemedel , för att rikta in sig på specifika biologiska processer eller brister genom att använda en specifik knockout, eller för att förstå verkningsmekanismen för ett läkemedel genom att använda ett bibliotek av knockout - organismer som spänner över hela genomet , t.ex. som i Saccharomyces cerevisiae .

Se även

externa länkar