Gen knock-in

Inom molekylär kloning och biologi hänvisar en gen-knock-in (förkortning: KI ) till en genteknikmetod som involverar en-till-en-substitution av DNA-sekvensinformation i ett genetiskt lokus eller infogning av sekvensinformation som inte finns inom lokuset . Vanligtvis görs detta i möss eftersom tekniken för denna process är mer förfinad och det finns en hög grad av delad sekvenskomplexitet mellan möss och människor. Skillnaden mellan knock-in-teknik och traditionella transgena tekniker är att en knock-in involverar en gen som sätts in i ett specifikt lokus, och är således en "riktad" insättning. Det är motsatsen till genknockout .

En vanlig användning av knock-in-teknik är att skapa sjukdomsmodeller. Det är en teknik genom vilken vetenskapliga forskare kan studera funktionen hos det reglerande maskineriet (t.ex. promotorer ) som styr uttrycket av den naturliga gen som ersätts. Detta uppnås genom att observera den nya fenotypen av organismen i fråga. BAC och YAC används i detta fall så att stora fragment kan överföras .

Metod

Gen knock-in har sitt ursprung som en liten modifiering av den ursprungliga knockouttekniken utvecklad av Martin Evans , Oliver Smithies och Mario Capecchi . Traditionellt har knock-in-tekniker förlitat sig på homolog rekombination för att driva riktad genersättning, även om andra metoder som använder ett transposonmedierat system för att infoga målgenen har utvecklats. Användningen av loxP- flankerande ställen som skärs ut vid uttryck av Cre-rekombinas med genvektorer är ett exempel på detta. Embryonala stamceller med modifieringen av intresse implanteras sedan i en livskraftig blastocyst , som kommer att växa till en mogen chimär mus med vissa celler som har den ursprungliga genetiska informationen från blastocystcellen och andra celler som har modifieringarna införda i de embryonala stamcellerna. Efterföljande avkomma till den chimära musen kommer då att ha genen knock-in.

Gene knock-in har för första gången möjliggjort hypotesdrivna studier av genmodifieringar och resulterande fenotyper. Mutationer i den humana p53- genen, till exempel, kan induceras genom exponering för benso(a)pyren (BaP) och den muterade kopian av p53-genen kan infogas i musgenom. Lungtumörer som observerats i knock-in mössen ger stöd för hypotesen om BaP:s cancerogenicitet . Nyare utvecklingar inom knock-in-teknik har gjort det möjligt för grisar att ha en gen för grönt fluorescerande protein infogat med ett CRISPR/Cas9- system, vilket möjliggör mycket mer exakta och framgångsrika geninsättningar. Hastigheten för CRISPR/Cas9-medierad gen-knock-in möjliggör också att bialleliska modifieringar av vissa gener kan genereras och fenotypen hos möss observeras i en enda generation, en aldrig tidigare skådad tidsram.

Versus gen knockout

Knock-in-teknologi skiljer sig från knockout- teknik genom att knockout-teknik syftar till att antingen radera en del av DNA-sekvensen eller infoga irrelevant DNA-sekvensinformation för att störa uttrycket av ett specifikt genetiskt lokus. Gen knock-in-teknologi, å andra sidan, förändrar det genetiska stället av intresse via en en-till-en-substitution av DNA-sekvensinformation eller genom tillägg av sekvensinformation som inte finns på nämnda genetiska lokus. En gen-knock-in kan därför ses som en gain-of-function-mutation och en gen-knockout en förlust-of-function-mutation , men en gen-knock-in kan också innebära att ett funktionellt genlokus ersätts med en mutant fenotyp som resulterar i viss funktionsförlust.

Potentiella applikationer

På grund av framgången med gen-knock-in-metoder hittills kan många kliniska tillämpningar föreställas. Knock-in av sektioner av den humana immunglobulingenen i möss har redan visat sig tillåta dem att producera humaniserade antikroppar som är terapeutiskt användbara. Det borde vara möjligt att modifiera stamceller hos människor för att återställa riktad genfunktion i vissa vävnader, till exempel eventuellt korrigera den muterade gammakedjegenen av IL-2-receptorn i hematopoetiska stamceller för att återställa lymfocytutvecklingen hos personer med X-länkad svår kombinerad immunbrist .

Begränsningar

Även om gen-knock-in-teknologi har visat sig vara en kraftfull teknik för att skapa modeller av mänskliga sjukdomar och insikt i proteiner in vivo , finns det fortfarande många begränsningar. Många av dessa delas med knockoutteknikens begränsningar. För det första leder kombinationer av knock-in gener till växande komplexitet i interaktionerna som insatta gener och deras produkter har med andra delar av genomet och kan därför leda till fler biverkningar och svårförklarliga fenotyper . Dessutom har endast ett fåtal loci, såsom ROSA26 -lokuset karakteriserats tillräckligt bra där de kan användas för villkorad gen knock-ins; gör kombinationer av reporter och transgener i samma locus problematiska. Den största nackdelen med att använda gen knock-in för att skapa mänskliga sjukdomsmodeller är att musfysiologi inte är identisk med den hos människor och mänskliga ortologer av proteiner uttryckta i möss kommer ofta inte helt att återspegla rollen som en gen i mänsklig patologi. Detta kan ses hos möss producerade med ΔF508 fibrosmutation i CFTR-genen , som står för mer än 70% av mutationerna i denna gen för den mänskliga befolkningen och leder till cystisk fibros . Medan ΔF508 CF-möss uppvisar de bearbetningsdefekter som är karakteristiska för den mänskliga mutationen, uppvisar de inte de lungpatofysiologiska förändringarna som ses hos människor och bär praktiskt taget ingen lungfenotyp. Sådana problem skulle kunna förbättras genom användningen av en mängd olika djurmodeller, och grismodeller (grislungor delar många biokemiska och fysiologiska likheter med mänskliga lungor) har genererats i ett försök att bättre förklara aktiviteten av ΔF508-mutationen.

Se även

externa länkar

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Gene_knock-in&oldid=1135880335 "