Transkriptionsaktivatorliknande effektornukleas

Spacefill-ritning av dimerisk TALE-FokI-fusion (blå: TALE; grön: FokI) bunden till DNA (), av David Goodsell

Transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser ( TALEN ) är restriktionsenzymer som kan konstrueras för att skära specifika sekvenser av DNA. De tillverkas genom att fusionera en TAL-effektor -DNA-bindande domän till en DNA-klyvningsdomän (ett nukleas som skär DNA-strängar). Transkriptionsaktivatorliknande effektorer (TALEs) kan konstrueras för att binda till praktiskt taget vilken önskad DNA-sekvens som helst, så när den kombineras med ett nukleas kan DNA skäras på specifika platser. Restriktionsenzymerna kan införas i celler, för användning i genredigering eller för genomredigering in situ , en teknik som kallas genomredigering med konstruerade nukleaser . Vid sidan av zinkfingernukleaser och CRISPR/Cas9 är TALEN ett framstående verktyg inom genomredigering .

TALE DNA-bindande domän

TAL-effektorer är proteiner som utsöndras av Xanthomonas -bakterier via deras typ III-sekretionssystem när de infekterar växter . Den DNA-bindande domänen innehåller en upprepad högkonserverad sekvens på 33–34 aminosyror med divergerande 12:e och 13:e aminosyror. Dessa två positioner, kallade Repeat Variable Diresidue (RVD), är mycket varierande och visar en stark korrelation med specifik nukleotidigenkänning . Detta enkla förhållande mellan aminosyrasekvens och DNA-igenkänning har möjliggjort konstruktion av specifika DNA-bindande domäner genom att välja en kombination av upprepade segment som innehåller lämpliga RVD. Särskilt kan små förändringar i RVD och införlivandet av "icke-konventionella" RVD-sekvenser förbättra målspecifikiteten.

DNA-klyvningsdomän

Den icke-specifika DNA-klyvningsdomänen från änden av Fokl -endonukleaset kan användas för att konstruera hybridnukleaser som är aktiva i en jästanalys. Dessa reagenser är också aktiva i växtceller och i djurceller. Initiala TALEN-studier använde vildtyps-FokI-klyvningsdomänen, men vissa efterföljande TALEN-studier använde också FokI-klyvningsdomänvarianter med mutationer utformade för att förbättra klyvningsspecificitet och klyvningsaktivitet. Fokl-domänen fungerar som en dimer, som kräver två konstruktioner med unika DNA-bindande domäner för platser i målgenomet med rätt orientering och avstånd. Både antalet aminosyrarester mellan TALE DNA-bindningsdomänen och Fokl-klyvningsdomänen och antalet baser mellan de två individuella TALEN-bindningsställena verkar vara viktiga parametrar för att uppnå höga nivåer av aktivitet.

Engineering TALEN konstruktioner

Det enkla förhållandet mellan aminosyrasekvens och DNA-igenkänning av TALE-bindningsdomänen möjliggör effektiv konstruktion av proteiner. I detta fall artificiell gensyntes problematisk på grund av felaktig hybridisering av den repetitiva sekvensen som finns i TALE-bindningsdomänen. En lösning på detta är att använda ett allmänt tillgängligt program (DNAWorks) för att beräkna oligonukleotider som är lämpliga för montering i en tvåstegs PCR -oligonukleotidsammansättning följt av helgenamplifiering. Ett antal modulära monteringsscheman för att generera konstruerade TALE-konstruktioner har också rapporterats. Båda metoderna erbjuder ett systematiskt tillvägagångssätt för att konstruera DNA-bindande domäner som konceptuellt liknar den modulära sammansättningsmetoden för generering av zinkfinger- DNA-igenkänningsdomäner.

Arbetsflöde för genomredigering av din favoritgen (YFG) med hjälp av TALEN. Målsekvensen identifieras, en motsvarande TALEN-sekvens konstrueras och infogas i en plasmid. Plasmiden sätts in i målcellen där den translateras för att producera den funktionella TALEN, som går in i kärnan och binder och klyver målsekvensen. Beroende på applikationen kan detta användas för att introducera ett fel (att slå ut en målgen) eller för att introducera en ny DNA-sekvens i målgenen.

Transfektion

När TALEN-konstruktionerna väl har satts samman, infogas de i plasmider ; målcellerna transfekteras sedan med plasmiderna, och genprodukterna uttrycks och går in i kärnan för att komma åt genomet. Alternativt kan TALEN-konstruktioner levereras till cellerna som mRNA, vilket tar bort möjligheten till genomisk integrering av det TALEN-uttryckande proteinet. Användning av en mRNA-vektor kan också dramatiskt öka nivån av homologistyrd reparation (HDR) och framgången för introgression under genredigering.

Genom redigering

Mekanismer

TALEN kan användas för att redigera genom genom att inducera dubbelsträngsbrott (DSB), som celler svarar på med reparationsmekanismer.

Icke-homolog ändkoppling (NHEJ) ligerar DNA direkt från vardera sidan av ett dubbelsträngsbrott där det finns mycket liten eller ingen sekvensöverlappning för hybridisering. Denna reparationsmekanism inducerar fel i genomet via indels (insertion eller deletion), eller kromosomal omarrangemang; sådana fel kan göra att genprodukterna som kodas på den platsen inte fungerar. Eftersom denna aktivitet kan variera beroende på art, celltyp, målgen och nukleas som används, bör den övervakas när nya system utformas. En enkel heteroduplex-klyvningsanalys kan köras som detekterar eventuell skillnad mellan två alleler amplifierade med PCR. Klyvningsprodukter kan visualiseras på enkla agarosgeler eller plattgelsystem.

Alternativt kan DNA införas i ett genom genom NHEJ i närvaro av exogena dubbelsträngade DNA-fragment.

Homologiriktad reparation kan också introducera främmande DNA vid DSB eftersom de transfekterade dubbelsträngade sekvenserna används som mallar för reparationsenzymerna.

Ansökningar

TALEN har använts för att effektivt modifiera växtgenom och skapa ekonomiskt viktiga matgrödor med gynnsamma näringsegenskaper. De har också utnyttjats för att utveckla verktyg för produktion av biobränslen . Dessutom har den använts för att konstruera stabilt modifierade mänskliga embryonala stamceller och inducerade pluripotenta stamcells (IPSC)-kloner och humana erytroida cellinjer, för att generera knockout C. elegans , knockout-råttor , knockout-möss och knockout- zebrafiskar . Dessutom kan metoden användas för att generera knockin-organismer. Wu et al. erhöll en Sp110 knockin-boskap med användning av Talen-nickaser för att inducera ökad resistens mot tuberkulos. Detta tillvägagångssätt har också använts för att generera knockin-råttor genom TALEN mRNA-mikroinjektion i encelliga embryon.

TALEN har också använts experimentellt för att korrigera de genetiska fel som ligger bakom sjukdomen. Till exempel har det använts in vitro för att korrigera genetiska defekter som orsakar störningar som sicklecellssjukdom , xeroderma pigmentosum och epidermolysis bullosa . Nyligen visades det att TALEN kan användas som verktyg för att utnyttja immunförsvaret för att bekämpa cancer; TALEN-medierad målinriktning kan generera T-celler som är resistenta mot kemoterapeutiska läkemedel och visar antitumöraktivitet.

I teorin tillåter den genomgående specificiteten hos konstruerade TALEN-fusioner korrigering av fel vid individuella genetiska loci via homologiriktad reparation från en korrekt exogen mall. I verkligheten är emellertid in situ -applikationen av TALEN för närvarande begränsad av avsaknaden av en effektiv leveransmekanism, okända immunogena faktorer och osäkerhet i specificiteten för TALEN-bindning.

En annan framväxande tillämpning av TALEN är dess förmåga att kombinera med andra genomteknikverktyg, såsom meganukleaser . Den DNA-bindande regionen av en TAL-effektor kan kombineras med klyvningsdomänen av ett meganukleas för att skapa en hybridarkitektur som kombinerar enkelheten för ingenjörskonst och mycket specifik DNA-bindningsaktivitet hos en TAL-effektor med den låga platsfrekvensen och specificiteten hos ett meganukleas.

I jämförelse med andra genomredigeringstekniker hamnar TALEN i mitten när det gäller svårighetsgrad och kostnad. Till skillnad från ZFNs känner TALEN igen enstaka nukleotider. Det är mycket enklare att konstruera interaktioner mellan TALEN DNA-bindande domäner och deras målnukleotider än att skapa interaktioner med ZFN och deras målnukleotidtripletter. Å andra sidan CRISPR på ribonukleotidkomplexbildning istället för protein/DNA-igenkänning. gRNA har ibland begränsningar vad gäller genomförbarhet på grund av bristen på PAM-ställen i målsekvensen och även om de kan produceras billigt, leder den nuvarande utvecklingen till en anmärkningsvärd kostnadsminskning för TALENs, så att de ligger i ett liknande pris- och tidsintervall som CRISPR-baserad genomredigering.

TAL effektor nukleas precision

Aktiviteten utanför målet hos ett aktivt nukleas kan leda till oönskade dubbelsträngsbrott och kan följaktligen ge kromosomala omarrangemang och/eller celldöd. Studier har utförts för att jämföra den relativa nukleasassocierade toxiciteten hos tillgängliga teknologier. Baserat på dessa studier och det maximala teoretiska avståndet mellan DNA-bindning och nukleasaktivitet, tros TALEN-konstruktioner ha den största precisionen av de för närvarande tillgängliga teknologierna.

Se även

externa länkar

E-TALEN.org Ett omfattande verktyg för TALEN-design
PDB Månadens molekyl En post i proteindatabasens månatliga strukturella höjdpunkt