Botryosphaeran

Botryosphaeran

Identifierare
Om inte annat anges ges data för material i standardtillstånd (vid 25 °C [77 °F], 100 kPa). Infobox referenser

Botryosphaeran är en exopolysackarid (EPS) som produceras av ascomyceteösa svampen Botryosphaeria rhodina . Karakterisering av den kemiska strukturen hos botryosphaeran visade att denna EPS var en (1→3)(1→6)-β-D-glukan. Denna speciella β-glukan kan produceras av flera stammar av Botryosphaeria rhodina som inkluderar: MAMB-05, DABAC-P82 och RCYU 30101. Botryosphaeran uppvisar intressanta reologiska egenskaper och nya biologiska funktioner inklusive hypoglykemi , hypokolesterolemi , anticancer och anticancer . verksamhet, med potentiella kommersiella tillämpningar. Tre kosmetiska produkter formulerade med botryosphaeran har utvecklats för att främja hudhälsa och behandla hudåkommor för framtida avsedda kommersialiseringsändamål.

Historia

Ascomyceten och trådsvampen , Botryosphaeria rhodina ( stam MAMB-05), isolerades från en kräfta på stammen av ett eukalyptträd och karakteriserades molekylärt genom sekvensering av den Internal Transkriberade Spacer- regionen (ITS) av rDNA .

glukanen , botryosphaeran, upptäcktes av misstag 1994 när man odlade Botryosphaeria rhodina MAMB-05 på näringsmedia som innehåller glukos för att producera enzymet laccase . Detta svampisolat producerar ett konstitutivt laccas som kan induceras till högre enzymtitrar av olika ligninliknande aromatiska föreningar , och särskilt veratrylalkohol . Svampen visade sig vara ligninolytisk.

Botryosphaeran utsöndras av svampen under tillväxten och uppträder i jäsningsbuljongen där dess närvaro orsakar en ökning av buljongens viskositet . Den kan lätt extraheras från buljongen genom utfällningsmetoder . Veratryl alkohol undertrycker dock bildandet av botryosphaeran.

Produktion och isolering

Botryosphaeran produceras under jäsningsförhållanden under vatten när Botryosphaeria rhodina MAMB-05 odlas på näringsmedia som innehåller glukos och mineralsalter. Att extrahera jäsningsbuljongen med alkohol gör att EPS (botryosphaeran) fälls ut från lösningen, och detta kan separeras genom centrifugering eller filtrering .

Den utvunna fällningen kan lyofiliseras till ett vitt fibröst material som är svårlösligt i vatten. Alternativt återsolubiliseras den återvunna fällningen i vatten (varsam upphettning under omrörning) för att bilda en viskös lösning som bildar en fast gel när den kyls till 5 °C. Solubilisering av botryosphaeran kan förbättras genom kemisk derivatisering med olika funktionella grupper .

Inverkan av sammansättningen av näringsmediet, inklusive kväve, fosfat, mineraler, kosttillskott ( sojaolja , Tween 80 ) och kolkällan ( kolhydrater ), är viktig för att öka produktionen av botryosphaeran och biomassa under fermentering av Botryosphaeria rhodina MAMB -05.

Katabolitrepression och närvaron av β-glukanhydrolyserande enzymer som angriper botryosphaeran under fermenteringsprocessen är kritiska och begränsar produktionen av botryosphaeran.

Statistiska faktoriell designmetoder , såsom responsytmetodologin (RSM), är effektiva för att undersöka komplexa fermentationsparametrar och deras interaktioner för att optimera metabolitproduktion av mikroorganismer . RSM hjälper till att definiera effekterna och interaktionerna av de fysiologiska faktorer som spelar en roll i bioteknologiska processer vid produktionen av mikrobiella metaboliter inklusive exopolysackarider som β-glukaner. Statistiska metoder minskar antalet experiment för att ge tillräcklig information för statistiskt acceptabla resultat.

Valideringen av jäsningsparametrarna genom statistisk faktoriell design förbättrade botryosphaeranproduktion av Botryosphaeria rhodina MAMB-05 över ooptimerade förhållanden.

Botryosphaeria rhodina MAMB-05 producerar en familj av botryosphaerans när den odlas på näringsmedia som innehåller olika kolhydratsubstrat. Dessa β-glukaner skiljer sig endast i omfattningen och frekvensen av sidokedjesubstituenter .

Botryosphaeranproduktionen kan förbättras när Botryosphaeria rhodina MAMB-05 odlas på glukosmedier som innehåller sojabönolja och det ytaktiva ämnet Tween 80.

Den mest attraktiva egenskapen för kommersialiseringen av botryosphaeran är den lätthet med vilken det kan framställas genom enkla jäsningsprocesser på billiga näringsmedier, och dess efterföljande isolering genom utfällning med etanol, vilket allt sker på en tidsskala av dagar jämfört med till andra kommersiella β-glukaner tillgängliga på marknaden. De senare utvinns från svampfruktkroppar ( svampar , svampfästen), förbrukad bryggjäst och spannmålskorn (korn, havre) som kan ta veckor till månader att förbereda.

Myceliet från Botryosphaeria rhodina MAMB-05 är en rik källa till β-glukaner .

Kemisk struktur

Den kemiska strukturen hos botryosphaeran beskrevs första gången 2003 och bestämdes med hjälp av metoderna: metyleringsanalys , Smith-nedbrytning, gaskromatografi-masspektroskopi ( GC-MS ) och ^13C NMR .

Hydrolys

Total syrahydrolys av botryosphaeran producerar endast D-glukos , medan partiell syrahydrolys och enzymatisk hydrolys producerar en serie homologa glukos- oligosackarider med olika grader av polymerisation , som kan analyseras med högpresterande vätskekromatografi (HPLC).

Enzymatisk nedbrytning av botryosphaeran under kontrollerade förhållanden med användning av enzymerna: β-(1→3) -glukanaser och β-(1→6)-glukanaser från Botryosphaeria rhodina MAMB-05, Trichoderma harzianum Rifai och Aureobasidium pullulans a mixed serier, producerar av β-(1→3)- och β-(1→6)-kopplade gluko-oligosackarider som kan fungera som prebiotika .

Enzymer som hydrolyserar botryosphaeran kan erhållas genom att odla Botryosphaeria rhodina MAMB-05, Trichoderma harzianum Rifai och Aureobasidium pullulans 1WA1 på näringsmedier som innehåller antingen botryosphaeran eller biomassan härledd från Botryosphaeria rhodina , som är en βg-rik källa till MAMB.

Prebiotika som de (1→3)-kopplade glukos-oligosackariderna dyker upp som näringsämnen för inkludering i livsmedel. Botryosphaeran kan tjäna som en källa för att bekvämt generera dessa oligosackarider genom enzymatisk hydrolys.

Kemisk strukturkarakterisering

Metylering och Smith-nedbrytningsanalys avslöjade att botryosphaeran utgjorde en ryggradskedja som består av (1→3)-β-kopplade glukosrester (dvs. det är en (1→3)-β-D-glukan) med β-(1→ 6)-kopplad glukos och di-glukos ( gentiobios ) sidogrenar belägna vid C-6-positionen av glukos längs den (1→3)-kopplade ryggradskedjan. Den kemiska strukturen hos botryosphaeran är en (1→3)(1→6)-β-D-glukan. ^13C NMR-spektroskopi bekräftade dess struktur.

Graden av förgrening av familjen botryosphaerans varierar från 21 till 31%. beroende på kolhydratkällan i näringsmediet under jäsning av svampen, och detta påverkar också molekylvikten ( MW) för de producerade botryosphaeranerna, som kan vara stor (ordningen >1 x 10 ⁶ Dalton)

Botryosphaeran existerar i en trippelspiralkonformation , en viktig strukturell egenskap för att manifestera biologiska svarsmodifierande aktiviteter .

Derivatisering av botryosphaeran genom karboximetylering och sulfonylering resulterar i förbättrad löslighet i vatten och minskar dess viskösa natur i lösning.

I fallet med sulfonerad botryosphaeran uppvisade den kemiskt modifierade polysackariden innehållande sulfonatgrupper nya biologiska funktioner: antikoagulering och antiviral aktivitet mot höljevirus som mänsklig herpes simplex och Dengue , Det senare är ett myggburet virus .

Besläktade exopolysackarider (β-glukaner) från flera stammar av Botryosphaeria rhodina ( teleomorfen Lasiodiplodia theobromae ) isolerade från ruttnande tropiska frukter har beskrivits. De kemiska strukturerna av tre producerade β-glukaner karakteriserades; en (1→3)(1→6)-β-D-glukan med en enda glukosrepeterande substituent (frekvens på 20%), en ogrenad (1→6)-β-glukan vid namn lasiodiplodan och en ny ( 1 → 3)(1→6)-p-glukan med unika grenar innefattande gentiobios- och gentiotriosrester , men inte glukos.

Strukturell karakterisering av cellväggen ( mycelium ) hos Botryosphaeria rhodina MAMB-05 avslöjade närvaron av tre olika D- glukaner ; en linjär (1→6)-β-glukan, en grenad (1→3)(1→6)-β-glukan med enkla glukosrepeterande grenar (frekvens på 18%) och en glykogenliknande (1→ 4 ) (1→6)-a-glukan.

Biosäkerhet

Botryosphaeran visades i omfattande studier på möss och däggdjurscellinjer ( hamster, råtta, människa) att det inte var mutagent (bedömt med mikrokärntestet ), och inte heller genotoxiskt enligt Ames-testet och Comet-analysen .

När botryosphaeran administreras oralt till möss genom sondmatning minskade den klastogena effekten av cyklofosfamid -inducerad mikrokärnbildning i benmärg ( polykromatiska erytrocyter ) och perifera blodceller ( retikulocyter ) .

Med användning av däggdjurscellinjer: lungfibroblaster ( kinesisk hamster ) och hepatokarcinomceller (råtta), bekräftades botryosphaeran inte vara mutagen eller genotoxisk genom mikrokärntestet och Comet-analysprocedurerna. Botryosphaeran uppvisade ingen mutagenicitet och skyddade odlade humana helblodslymfocyter mot DNA -skada och celldöd inducerad av bleomycin under hela cellcykelstadiet . skador inducerade av metylmetansulfonat , i normala och ( ) humana lymfocyter.

Frånvaron av mutagenicitet och genotoxicitet bedömd av mikrokärn-, Ames- och MTT- testerna och Comet-analysen, fastställde att botryosphaeran har GRAS -status (allmänt rekommenderad som säker) och är säker för användning av människor och djur.

Reologiska egenskaper

De reologiska egenskaperna hos botryosphaeran har beskrivits.

Botryosphaeran bildar en viskös lösning när den löses upp i vatten som är stabilt mot värme som sker under autoklavering (ångsterilisering ) . När en vattenlösning av botryosphaeran kyls till 5 °C, bildar den en stark gel som är fast och transparent.

Biologiska funktioner

Botryosphaeran har in vitro- fångande egenskaper för fria radikaler och antioxidantaktiviteter .

Botryosphaeran uppvisar en antioxidantroll in vivo i β-cellinjen INS-1E härrörande från råttinsulinom ( tumör i bukspottkörteln härrörande från β-celler). Oxidativ stress inducerades av väteperoxid (H ₂ O ₂ ) i INS-1E-cellerna under hög glukos , och botryosphaeran minskade detta tillstånd genom att minska produktionen av reaktiva syrearter (ROS). Apoptos ökade i INS-1E-cellerna behandlade med H ₂ O ₂ under höga glukostillstånd, och behandling med botryosphaeran försvagad apoptos.

Botryosphaeran utövar en kemoskyddande effekt som uppvisar stark antimutagen (antiklastogen) aktivitet mot den in vivo -skadande effekten av cyklofosfamid i möss., och genotoxisk skada av doxorubicin i fibroblaster och hepatokarcinomceller, bleomycin i humana lymfatiska metanocyter] citatocyter i Jurkat-celler.

Botryosphaeran uppvisar hypoglykemisk aktivitet (sänkning av blodsockernivåer) hos råttor där diabetes inducerats genom intramuskulär injektion av streptozotocin , vilket selektivt skadar de pankreatiska insulinutsöndrande β-cellerna, vilket resulterar i typ-1 diabetestillstånd .

Den kolesterolsänkande effekten (hypokolesterolemi) av β-glukaner som härrör från havre och korn (β-(1→3)(1→4)-kopplade D-glukaner) är väl etablerad. Botryosphaeran uppvisar hypokolesterolemisk aktivitet som sänker totalt kolesterol och nivåer av lågdensitetslipoprotein (LDL)-kolesterol i blodet hos råttor som förbehandlats med hyperlipidemisk diet.

I experiment med äldre manliga knockout LDLr ^-/- möss ( LDL-receptorbristiga möss som visar förhöjda plasmakolesterolnivåer och utvecklar åderförkalkning ), minskade botryosphaeran plasmaglukosnivåerna , förbättrade lipidprofilerna , minskade LDL-kolesterol och minskade nedfallet av aortalipid . minskar kardiovaskulära risker för åderförkalkning .

Behandling av överviktiga råttor med botryosphaeran genom sondmatning var effektiv för att lindra komorbiditeter (diabetes, dyslipidemi , leversteatos ) förknippade med fetma. Botryosphaeran minskar leversteatos och dyslipidemi och glukosintolerans hos dietinducerade feta råttor genom aktivering av AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK) och uttrycket av Forkhead-transkriptionsfaktorn , FOXO3a, i fettvävnad .

Överviktiga råttor visade signifikanta ökningar i viktökning , fettvävnadsmassa och fett och aterogena index , och visade glukosintolerans, insulinresistens , dyslipidemi och leversteatos. Botryosphaeran minskar avsevärt foderintag, viktökningar, periepididymalt och mesenteriskt fett och förbättrar glukostoleransen hos överviktiga råttor. Botryosphaeran minskar dessutom serumnivåerna av triglycerider och VLDL-kolesterol och ökat HDL-kolesterol och glykogen i levern och minskar det aterogena indexet.

Ovanstående data visade de fördelaktiga effekterna av botryosphaeran för att minska den stimulerande effekten av fetma på dyslipidemi och leversteatos, och kan spela en potentiell roll i hanteringen av komorbiditeter med fetma.

Studier på humana karcinomcellinjer: Jurkat (lymfocyter) och bröst (MCF-7) visade att botryosphaeran uppvisar anti-canceraktivitet.

Åtgärden genom vilken anticanceraktivitet uppstår är fortfarande inte väl förstått, men en mekanistisk insikt om hur detta kan inträffa i bröstcancer -MCF-7-celler utvecklades 2015 och involverar cellsignaleringsvägar som undertrycker tumörbildning (cellantiproliferation ) genom apoptos, nekros och oxidativ stress . Botryosphaeran-inducerad apoptos medierades av AMPK och FOXO3a.

I tumörframkallande humana lymfocyter (Jurkat-celler) modulerar botryosphaeran genuttryck och reglerar cellcykeln och cellcykelns kontrollpunkt .

Inkapsling av probiotiska bakterier ( Lactobacillus casei ) i alginatmikrosfärer tillsammans med botryosphaeran och mucilages från linfrö och okra ökar inkapslingseffektiviteten och förbättrar stabiliteten hos de inkapslade probiotiska bakterierna under långvarig lagring vid 5 °C . Gastrointestinal simulering av de mikroinkapslade Lactobacillus casei- cellerna visade bevarande av livsdugligheten hos de probiotiska bakterierna mot lågt pH och gallsalter . Användningen av botryosphaeran i mikroinkapslande probiotiska bakterier verkar vara en annan lovande tillämpning för denna β-glukan.

Nya tillämpningar för botryosphaeran har inkluderat: biologiska responsmodifierande aktiviteter hos derivatiserade botryosphaeraner; behandling av hudåkommor ( eksem , psoriasis , sårläkning ); antimikrobiella aktiviteter; antinociceptiv aktivitet; som en matris för enzym (lakkas) immobilisering ; som en plattform för elektrokemiska sensorer ; och som en livsmedelstillsats ( nutraceutical ).

Biomassan från Botryosphaeria rhodina MAMB-05 vid framställning av botryosphaeran genom nedsänkt jäsning har framgångsrikt använts som biosorbent för att extrahera metalliska arter ; sällsynta jordartsmetaller ( lantanider ; La , Sm ) och tungmetaller ( bly ; Pb) från industriella avloppsvatten .