Immobiliserat enzym

Ett immobiliserat enzym är ett enzym , med begränsad rörlighet, fäst till ett inert, olösligt material - såsom kalciumalginat (framställt genom att reagera en blandning av natriumalginatlösning och enzymlösning med kalciumklorid ). Detta kan ge ökat motstånd mot förändringar i förhållanden som pH eller temperatur . Det låter också enzymer hållas på plats under hela reaktionen, varefter de lätt separeras från produkterna och kan användas igen - en mycket effektivare process och därför används flitigt inom industrin för enzymkatalyserade reaktioner . Ett alternativ till enzymimmobilisering är helcellsimmobilisering . Immobiliserade enzymer är lätta att hantera, enkelt separeras från sina produkter och kan återanvändas.

Enzymer är biokatalysatorer som spelar en viktig roll för att förstärka kemiska reaktioner i celler utan att ihållande modifieras, slösas bort och inte heller resultera i förlust av jämvikt för kemiska reaktioner. Även om egenskaperna hos enzymer är extremt unika, är deras användbarhet i branschen begränsad på grund av bristen på återanvändbarhet, stabilitet och höga produktionskostnader.

Enzymer immobiliserade i pärlor av alginatgel

Historia

Det första syntetiska immobiliserade enzymet gjordes på 1950-talet, utfört genom inkludering av enzym i polymera matriser eller bindning till bärarsubstanser. Även tvärbindningsförfarandet tillämpades genom tvärbindning av protein enbart eller tillsammans med tillsats av inerta material. Under det senaste decenniet har olika immobiliseringsmetoder utvecklats. Att binda enzymet till tidigare syntetiserade bärarmaterial är till exempel den mest föredragna metoden hittills. Nyligen anses förfarandet för tvärbindning av enzymkristaller också vara ett spännande substitut. Utnyttjandegraden av immobiliserade enzymer ökar konstant.

Överväganden

Innan du utför någon form av immobiliseringsteknik, bör vissa faktorer vara i åtanke. Det är nödvändigt att förstå de kemiska och fysikaliska effekterna på ett enzym efter immobilisering. Enzymstabilitet och kinetiska egenskaper kan förändras på grund av förändringar i mikromiljöförhållandena för enzymet efter infångning, fastsättning av stödmaterial eller produkter av enzymatiska verkan till exempel. Dessutom är det viktigt att överväga att bibehålla den tertiära strukturen av ett enzym innan immobilisering för att få ett funktionellt enzym. På liknande sätt är ett annat avgörande ställe för funktionaliteten hos ett enzym det aktiva stället , som också bör bibehållas medan enzymet fästs till en yta för immobilisering, det är ett måste att ha en selektiv metod för att fästa yta/material till inte sluta med ett immobiliserat, utan dysfunktionellt enzym. Följaktligen finns det tre grundläggande faktorer att tänka på för produktionen av funktionella immobiliserade enzymer: immobilisering stöder urval, betingelser och metoder för immobilisering.

Supportval

För att ett stödmaterial ska vara idealiskt måste det vara hydrofilt , inert mot enzymer, biokompatibelt , mikrobiellt attack- och kompressionsresistent och måste vara överkomligt. Stödmaterial kan vara organiska eller oorganiska, syntetiska eller naturliga (beroende på sammansättningen), eftersom de är biomaterialtyper i slutet. Det finns ingen universell typ av bärarmaterial som kan användas för immobilisering av alla enzymer. Det finns dock några vanliga bärare som kiseldioxidbaserade bärare, akrylhartser , syntetiska polymerer , aktiva membran och utbyteshartser. En av de svåraste processerna före själva immobiliseringsprocessen är valet av stödmaterial eftersom det är beroende av enzymtyp, medias reaktion, hydrodynamiska säkerhetspolicy och reaktionsförhållanden. Eftersom olika typer av stöd ger olika fysikaliska och kemiska egenskaper och egenskaper, vilket skulle påverka enzymfunktionen, såsom: Hydrofilicitet / hydrofobicitet , ytkemi och porstorlek.

Metoder

Enzymer kan immobiliseras med fysikaliska eller kemiska metoder inklusive:

Fysisk

Adsorption

• En enkel metod för reversibel immobilisering, där enzymerna adsorberas eller fästs fysiskt på en stödsubstans. Adsorption kan ske genom svaga ospecifika krafter, såsom van der waals , vätebindningar och hydrofoba interaktioner, medan enzymerna vid jonbindning är bundna genom saltbindningar.
• Adsorption på glas, alginatpärlor eller matris: Enzymet är fäst på utsidan av ett inert material. I allmänhet är denna metod den långsammaste bland de som listas här. Eftersom adsorption inte är en kemisk reaktion , kan det aktiva stället för det immobiliserade enzymet blockeras av matrisen eller pärlan, vilket kraftigt minskar enzymets aktivitet.

Infångning

• Detta är en irreversibel fysisk immobiliseringsteknik som kan betraktas som en fysisk begränsning av enzym i ett specificerat område/utrymme. Den kan användas för att höja den mekaniska stabiliteten och kan också användas för att reducera läckage av enzymer. Eftersom enzymet i denna process inte interagerar kemiskt med polymeren/materialet i stödfibrerna/gittret, förblir det skyddat från denaturering med tiden.
• I grund och botten är enzymet fångat i olösliga pärlor eller mikrosfärer, såsom kalciumalginatpärlor . Dessa olösliga ämnen hindrar emellertid substratets ankomst och utsläpp av produkter.

Kemisk

Tvärbindning

• Tvärbindning : en annan irreversibel metod som inte kräver ett stödmaterial för bindning av enzymmolekyler. I denna teknik binds enzymernas molekyler kovalent till varandra för att skapa en matris som består av nästan bara enzym. Reaktionen säkerställer att bindningsstället inte täcker enzymets aktiva ställe , enzymets aktivitet påverkas endast av orörlighet. Oflexibiliteten hos de kovalenta bindningarna utesluter emellertid de självläkande egenskaperna som uppvisas av kemoadsorberade självmonterade monoskikt. Användning av en distansmolekyl som poly( etylenglykol ) hjälper till att reducera steriskt hinder av substratet i detta fall.

Kovalent bindning

• Enzymet är bundet kovalent till en olöslig bärare (såsom silikagel eller makroporösa polymerpärlor med epoxidgrupper). Detta tillvägagångssätt ger den starkaste enzym/stödinteraktionen, och så det lägsta proteinläckaget under katalys.
• Aktiviteten hos enzymet som är kovalent bundet beror på flera faktorer inklusive: form och storlek på bärarmaterialet, typ av kopplingsmetod, sammansättningen och speciella kopplingsförhållanden för bärarmaterialet.

Affinity-tag-bindning: är en immobiliseringsmetod som kombinerar fysikaliska och kemiska metoder där enzymer kan immobiliseras till en yta, t.ex. i ett poröst material, med användning av icke-kovalenta eller kovalenta proteintaggar . Denna teknologi har etablerats för proteinreningsändamål. Denna teknik är allmänt tillämpbar och kan utföras utan föregående enzymrening med ett rent preparat som resultat. Poröst glas och derivat därav används, där den porösa ytan kan anpassas vad gäller hydrofobicitet för att passa det aktuella enzymet.

Slumpmässigt kontra webbplatsinriktat

Många enzymer av bioteknologisk betydelse har immobiliserats på olika underlag (oorganiska, organiska, kompositer och nanomaterial) via slumpmässig flerpunktsfästning. Emellertid resulterar immobilisering via slumpmässig kemisk modifiering i en heterogen proteinpopulation där mer än en sidokedjor (amino, karboxyl, tiol etc) som finns i proteiner är kopplade till stödet med potentiell minskning av aktiviteten på grund av begränsning av substrattillgång till det aktiva stället .

I motsats härtill, vid platsriktad enzymimmobilisering, kan stödet kopplas till en enda specifik aminosyra (i allmänhet N- eller C-terminaler) i en proteinmolekyl bort från det aktiva stället. På detta sätt bibehålls maximal enzymaktivitet på grund av substratets fria tillgång till det aktiva stället. Dessa strategier är huvudsakligen kemiska men kan dessutom kräva genetiska och enzymatiska metoder för att generera funktionella grupper (som saknas i protein) på stödet och enzymet.

Valet av SDCM-metod beror på många faktorer, såsom typen av enzym (mindre stabil psykrofil eller mer stabil termofil homolog), enzymets pH-stabilitet, tillgängligheten av N- eller C-terminaler till reagenset, icke-interferens av enzymterminalen med enzymaktivitet, typ av katalytisk aminosyrarest, tillgänglighet, pris och enkel framställning av reagens. Till exempel är genereringen av komplementära klickbara funktionaliteter (alkyn och azid) på underlaget och enzymet ett av de mest bekväma sätten att immobilisera enzymer via platsriktad kemisk modifiering.

Immobilisering av substrat

En annan allmänt använd tillämpning av immobiliseringsmetoden tillsammans med enzymer har varit de enzymatiska reaktionerna på immobiliserade substrat. Detta tillvägagångssätt underlättar analysen av enzymaktiviteter och efterliknar prestandan hos enzymer på t.ex. cellväggar.

Kommersiell användning

Immobiliserade enzymer har viktiga användningsområden eftersom de minskar kostnaderna och förbättrar resultatet av reaktionen de katalyserar. Fördelarna inkluderar:

Bekvämlighet

Minuskula mängder protein löses upp i reaktionen, så upparbetningen kan vara mycket lättare. Efter avslutad reaktion innehåller reaktionsblandningar vanligtvis endast lösningsmedel och reaktionsprodukter.

Ekonomi

Det immobiliserade enzymet avlägsnas lätt från reaktionen vilket gör det enkelt att återvinna biokatalysatorn . Detta är särskilt användbart i processer som produktion av laktosfri mjölk, eftersom mjölken kan tömmas från en behållare och lämnar enzymet ( Lactase ) inuti redo för nästa batch.

Stabilitet

Immobiliserade enzymer har vanligtvis större termisk och driftsstabilitet än den lösliga formen av enzymet.

Tidigare innehöll biologiska tvättmedel och tvättmedel många proteaser och lipaser som bröt ner smuts. Men när rengöringsprodukterna kom i kontakt med mänsklig hud skapade de allergiska reaktioner. Det är därför immobilisering av enzymer är viktig för många användningsområden.

Immobiliserade enzymer används i olika applikationer inklusive: livsmedels-, kemisk-, läkemedels- och medicinsk industri. Inom livsmedelsindustrin till exempel används immobiliserade enzymer för tillverkning av flera typer av kalorifria sötningsmedel, allulos är till exempel en epimer av fruktos , som är strukturellt annorlunda, vilket resulterar i att den inte kan absorberas av människokroppar när den intas. Ett annat exempel på immobiliserade enzymbaserade sötningsmedel inkluderar: Tagatos (immobiliserat p-galaktosidas) .

Även inom den kemiska (kosmetika) industrin används immobiliserade enzymer för framställning av mjukgörande estrar genom att använda immobiliserat CalB-enzym. Det första företaget som använde en sådan metod är Evonik år 2000. Enzymet Lipase-CalB i immobiliserat tillstånd används faktiskt i andra farmaceutiska tillämpningar för produktion av Odanacatib och Sofosbuvir .