Ames test
Ames -testet är en allmänt använd metod som använder bakterier för att testa om en given kemikalie kan orsaka mutationer i testorganismens DNA . Mer formellt är det en biologisk analys för att bedöma den mutagena potentialen hos kemiska föreningar. Ett positivt test indikerar att kemikalien är mutagen och därför kan verka som cancerframkallande , eftersom cancer ofta är kopplad till mutation . Testet fungerar som en snabb och bekväm analys för att uppskatta den cancerframkallande potentialen hos en förening eftersom standardkarcinogenanalyser på möss och råttor är tidskrävande (tar två till tre år att slutföra) och dyra. Dock är falska positiva och falska negativa kända.
Proceduren beskrevs i en serie artiklar i början av 1970-talet av Bruce Ames och hans grupp vid University of California, Berkeley .
Allmänt förfarande
Ames-testet använder flera stammar av bakterien Salmonella typhimurium som bär mutationer i gener som är involverade i histidinsyntesen . Dessa stammar är auxotrofa mutanter, dvs de kräver histidin för tillväxt, men kan inte producera det. Metoden testar det testade ämnets förmåga att skapa mutationer som resulterar i en återgång till ett "prototrofiskt" tillstånd, så att cellerna kan växa på ett histidinfritt medium.
Testarstammarna är speciellt konstruerade för att detektera antingen ramförskjutning (t.ex. stammar TA-1537 och TA -1538) eller punktmutationer (t.ex. stam TA-1531) i generna som krävs för att syntetisera histidin, så att mutagener som verkar via olika mekanismer kan identifieras. Vissa föreningar är ganska specifika och orsakar reversioner i bara en eller två stammar. Testarstammarna har också mutationer i generna som är ansvariga för lipopolysackaridsyntesen , vilket gör bakteriens cellvägg mer permeabel, och i excisionsreparationssystemet för att göra testet känsligare.
Större organismer som däggdjur har metaboliska processer som potentiellt kan förvandla en kemikalie som anses inte mutagen till en som är eller en som anses vara mutagen till en som inte är det. Därför, för att mer effektivt testa en kemisk förenings mutagenicitet i förhållande till större organismer, kan råttleverenzymer tillsättas i ett försök att replikera de metaboliska processernas effekt på föreningen som testas i Ames-testet. Råttleverextrakt tillsätts valfritt för att simulera effekten av metabolism , eftersom vissa föreningar, som benso[ a ]pyren , inte är mutagenta själva men deras metaboliska produkter är det.
Bakterierna sprids på en agarplatta med en liten mängd histidin. Denna lilla mängd histidin i tillväxtmediet gör att bakterierna kan växa under en första tid och har möjlighet att mutera. När histidinet är utarmat kommer endast bakterier som har muterats för att få förmågan att producera sin egen histidin att överleva. Plattan inkuberas i 48 timmar. Ett ämnes mutagenitet är proportionell mot antalet observerade kolonier.
Ames-test och cancerframkallande ämnen
Mutagener identifierade via Ames-testet är också möjliga cancerframkallande ämnen, och tidiga studier av Ames visade att 90 % av kända cancerframkallande ämnen kan identifieras via detta test. Senare studier visade dock identifiering av 50–70 % av kända cancerframkallande ämnen. [ citat behövs ] Testet användes för att identifiera ett antal föreningar som tidigare använts i kommersiella produkter som potentiella cancerframkallande ämnen. Exempel är tris(2,3-dibromopropyl)fosfat , som användes som flamskyddsmedel i plast och textilier som nattkläder för barn, och furylfuramid som användes som en antibakteriell tillsats i livsmedel i Japan på 1960- och 1970-talen. Furylfuramid hade faktiskt tidigare klarat djurförsök, men mer kraftfulla tester efter identifieringen i Ames-testet visade att det var cancerframkallande. Deras positiva tester resulterade i att dessa kemikalier togs bort från användning i konsumentprodukter.
Ett intressant resultat från Ames-testet är att dosresponskurvan med användning av olika koncentrationer av kemikalien nästan alltid är linjär, vilket indikerar att det inte finns någon tröskelkoncentration för mutagenes. Det tyder därför på att det, liksom med strålning, kanske inte finns någon säker tröskel för kemiska mutagener eller cancerframkallande ämnen. Vissa har dock föreslagit att organismer skulle kunna tolerera låga nivåer av mutagener på grund av skyddsmekanismer såsom DNA-reparation , och därför kan det finnas en tröskel för vissa kemiska mutagener. Bruce Ames själv argumenterade mot linjär dos-respons-extrapolering från den höga dosen som används i cancerförsök i djursystem till den lägre dosen av kemikalier som normalt förekommer vid mänsklig exponering, eftersom resultaten kan vara falska positiva på grund av mitogent svar orsakat av den artificiellt höga dosen kemikalier som används i sådana tester. Han varnade också för "hysterin över små spår av kemikalier som kan eller inte kan orsaka cancer", som "fullständigt driver ut de stora riskerna du bör vara medveten om".
Ames-testet används ofta som en av de första screeningarna för potentiella läkemedel för att sålla bort eventuella cancerframkallande ämnen, och det är ett av de åtta testerna som krävs enligt Pesticide Act (USA) och ett av de sex testerna som krävs enligt Toxic Substances Control Act (USA).
Begränsningar
Salmonella typhimurium är en prokaryot, därför är den inte en perfekt modell för människor. Råttlever S9-fraktion används för att efterlikna däggdjurens metaboliska tillstånd så att den mutagena potentialen hos metaboliter som bildas av en modermolekyl i leversystemet kan bedömas; det finns dock skillnader i metabolism mellan människor och råttor som kan påverka mutageniciteten hos de kemikalier som testas. Testet kan därför förbättras genom användning av human lever S9-fraktion; dess användning var tidigare begränsad av dess tillgänglighet, men den är nu tillgänglig kommersiellt och kan därför vara mer genomförbar. En anpassad in vitro- modell har gjorts för eukaryota celler, till exempel jäst.
Mutagener som identifierats i Ames-testet behöver inte nödvändigtvis vara cancerframkallande, och ytterligare tester krävs för eventuella cancerframkallande ämnen som identifierats i testet. Läkemedel som innehåller nitratdelen återkommer ibland positivt för Ames när de verkligen är säkra. Nitratföreningarna kan generera kväveoxid , en viktig signalmolekyl som kan ge ett falskt positivt. Nitroglycerin är ett exempel som ger en positiv Ames men används fortfarande i behandling idag. Nitrater i livsmedel kan dock reduceras genom bakteriell verkan till nitriter som är kända för att generera cancerframkallande ämnen genom att reagera med aminer och amider. Långa toxikologi- och resultatstudier behövs med sådana föreningar för att motbevisa ett positivt Ames-test.
Fluktuationsmetod
Ames-testet utvecklades initialt med användning av agarplattor (plattinkorporeringstekniken), som beskrivits ovan. Sedan dess har ett alternativ till att utföra Ames-testet utvecklats, vilket är känt som "fluktuationsmetoden". Denna teknik har samma koncept som den agarbaserade metoden, där bakterier tillsätts till en reaktionsblandning med en liten mängd histidin , vilket gör att bakterierna kan växa och mutera och återvända för att syntetisera sitt eget histidin. Genom att inkludera en pH-indikator, räknas mutationsfrekvensen i mikroplattor som antalet brunnar som har ändrat färg (orsakat av ett pH-fall på grund av metaboliska processer för att reproducera bakterier). Som med det traditionella Ames-testet jämförs provet med den naturliga bakgrundshastigheten för omvänd mutation för att fastställa ett ämnes genotoxicitet. Fluktuationsmetoden utförs helt i flytande kultur och poängsätts genom att räkna antalet brunnar som blir gula från lila i 96-brunnars eller 384-brunnars mikroplattor.
I 96-brunnars plattmetoden räknas mutationsfrekvensen som antalet brunnar av 96 som har ändrat färg. Plattorna inkuberas i upp till fem dagar, där muterade (gula) kolonier räknas varje dag och jämförs med bakgrundshastigheten för omvänd mutation med hjälp av etablerade tabeller av signifikans för att bestämma de signifikanta skillnaderna mellan bakgrundshastigheten för mutationen och den för de testade prover.
I den mer nedskalade mikrofluktuationsmetoden med 384-brunnars plattor räknas mutationsfrekvensen som antalet brunnar av 48 som har ändrat färg efter 2 dagars inkubation. Ett testprov analyseras över 6 dosnivåer med samtidig nolldos (bakgrund) och positiva kontroller som alla passar in i en platta med 384 brunnar. Analysen utförs i triplikat för att ge statistisk robusthet. Den använder de rekommenderade teststammarna från OECD Guideline 471 (histidin-auxotrofer och tryptofan-auxotrofer).
Fluktuationsmetoden är jämförbar med den traditionella hällplattmetoden när det gäller känslighet och noggrannhet, men den har ett antal fördelar: den behöver mindre testprov, den har en enkel kolorimetrisk slutpunkt, som räknar antalet positiva brunnar av ev. 96 eller 48 brunnar är mycket mindre tidskrävande än att räkna enskilda kolonier på en agarplatta. Flera kommersiella kit finns tillgängliga. De flesta kit har förbrukningsbara komponenter i ett färdigt tillstånd, inklusive lyofiliserade bakterier, och tester kan utföras med flerkanalspipetter. Fluktuationsmetoden gör det också möjligt att testa högre volymer av vattenhaltiga prover (upp till 75 % v/v), öka känsligheten och utöka dess tillämpning till lågnivåmiljömutagener.
Vidare läsning
- Phillipson, Caroline E.; Ioannides, Costas (1989-03-01). "Metabolisk verkan av polycykliska aromatiska kolväten till mutagener i Ames-testet av olika djurarter inklusive människa". Mutationsforskning/fundamentala och molekylära mekanismer för mutagenes . 211 (1): 147–151. doi : 10.1016/0027-5107(89)90115-2 . ISSN 0027-5107 . PMID 2493576 .
- McKinnell RG (2015-11-06). The Understanding, Prevention and Control of Human Cancer: The Historic Work and Lives of Elizabeth Cavert Miller and James A. Miller . SLÄTVAR. ISBN 9789004286801 .
- Claxton LD, Umbuzeiro GD, DeMarini DM (november 2010). "Salmonella mutagenicitetsanalysen: stetoskopet för genetisk toxikologi för 2000-talet" . Miljöhälsoperspektiv . 118 (11): 1515–22. doi : 10.1289/ehp.1002336 . PMC 2974687 . PMID 20682480 .
| Ombud | |
|---|---|
| Analyser |
|
