Forntida patogengenomik

Forntida patogengenomik är ett vetenskapligt område relaterat till studiet av patogengenom som utvinns från forntida mänskliga , växt- eller djurrester. Forntida patogener är mikroorganismer , nu utdöda, som under de senaste århundradena orsakat flera epidemier och dödsfall över hela världen. Deras genom , kallat forntida DNA (aDNA), är isolerat från begravningens rester (ben och tänder) av offer för pandemierna som orsakats av dessa patogener.

Analysen av de genomiska egenskaperna hos antika patogengenom gör det möjligt för forskare att förstå utvecklingen av moderna mikrobiella stammar som hypotetiskt kan generera nya pandemier eller utbrott. Analysen av aDNA utförs av bioinformatiska verktyg och molekylärbiologiska tekniker för att jämföra antika patogener med de moderna ättlingarna. Jämförelsen ger också fylogenetisk information om dessa stammar.

Rekonstruera antika patogengenom genom NGS-teknik

Patogen DNA-detektion i fornlämningar kan uppnås med laboratorie- eller beräkningsmetoder. I båda fallen börjar proceduren med extraktion av DNA från forntida exemplar. Laboratoriemetoderna baseras på uppbyggnaden av NGS- bibliotek och den efterföljande infångningsbaserade screeningen. Beräkningsverktyg används för att kartlägga de läsningar som erhålls av NGS mot en referens med enstaka eller flera genom (riktad ansats); alternativt metagenomisk profilering eller taxonomisk tilldelning av hagelgevärs NGS-läsmetoder tillämpas (bred ansats).

Isolera gammalt DNA

Det begränsade bevarandet och därmed låga förekomsten, det mycket fragmenterade och skadade tillståndet och förekomsten av modern DNA-kontamination och miljö-DNA-bakgrund gör återvinningen av forntida DNA ( aDNA ) till en utmanande procedur.

För att effektivt återvinna aDNA isoleras DNA i allmänhet från vävnader som innehåller en stor mängd aDNA, som ben och tänder, som finns rikligt med arkeologiska uppgifter. Bevarandet av patogener över olika anatomiska element är mycket varierande beroende på typen av patogen och dess vävnadstropism, dess väg in i kroppen och den resulterande sjukdomen. Patogener som orsakar kroniska infektioner i sina värdar producerar typiskt diagnostiska benförändringar i motsats till akuta blodburna infektioner. Därför, för infektioner som har orsakat värdens död i den akuta fasen, är det föredragna provtagningsmaterialet den inre kammaren i tänderna eftersom detta är en vävnad som är mycket vaskulariserad under livet.

aDNA kännetecknas av skador som ackumuleras under tidens lopp: utvärderingen av DNA-'skademönster' genom beräkningsverktyg är användbar för att autentisera forntida patogen-DNA eftersom samma mönster inte finns i moderna föroreningar.

Den mest representerade kemiska skadan som påverkar DNA post mortem är den hydrolytiska deamineringen av cytosiner, som omvandlar dem till uraciler, som sedan läses som tyminer. På grund av denna reaktion innehåller forntida DNA en oväntad andel av cytosin till tyminövergångar, särskilt i ändarna av molekylerna. Andra vanliga DNA-modifieringar, förutom deamineringen av cytosin till tymin (detta inträffar när cytosiner metylerades), är närvaron av abasiska ställen och enkelsträngsbrott.

aDNA är omfattande fragmenterat (de flesta av fragmenten är mindre än 100 baspar långa): denna tendens kan användas som ett kvantitativt mått på autenticitet, eftersom moderna kontaminantmolekyler förväntas vara längre. För att utnyttja denna karakteristiska egenskap hos forntida DNA introducerades förbättrade kiseldioxidbaserade extraktionsprotokoll med modifierad volym och sammansättning av den DNA-bindande bufferten .

Konstruktion av DNA-bibliotek

För att sekvenseras med andra generationens sekvenseringsmetoder måste mallmolekyler modifieras genom ligering av adaptorer. Både stegen för bibliotekskonstruktion och PCR -amplifieringen som följer är föremål för fel. Speciellt kan adapterbindningsförändringar förekomma och den relativa effektiviteten av PCR-enzymer vid amplifiering av konstruktionen kan variera.

Det finns tre vanligaste typerna av aDNA-bibliotek . Det dubbelsträngade DNA-biblioteket använder dubbelsträngade DNA-mallar och kräver först ett steg för reparation av ändarna av aDNA-fragment. Därefter ligeras fragment till dubbelsträngade adaptrar och de resulterande hackarna fylls i. Denna metod har vissa begränsningar, såsom närvaron av en fraktion av konstruktioner som inte innehåller både de olika adaptrarna och den möjliga bildningen av adaptordimerer.

För att övervinna detta senare problem utvecklades en metod för konstruktion av ett A-tailed-bibliotek. I denna metod ändrepareras aDNA och sedan läggs en adeninrest till 3'-ändarna av strängarna, vilket kan underlätta ligeringen av mallen med adaptrar som innehåller en skräddarsydd tymin. Dessutom förhindrar användningen av dessa T-svansadaptrar bildandet av adapterdimerer. Den typ av adapter som vanligtvis används är dubbelsträngad och har en Y-form, vilket betyder att den har en region som är placerad vid den T-svansade änden där den är komplementär och en region i den andra änden där den är icke-komplementär. Användningen av denna typ av adaptrar gör det möjligt att generera en mall av aDNA flankerad av olika icke-komplementära adaptorsekvenser i varje ände som är användbara för enkelriktad sekvensering.

En annan strategi är baserad på användningen av enkelsträngade DNA-bibliotek. I denna metod denatureras DNA först för att generera en enkelsträng genom värme och ligeras sedan till en enkelsträngad biotinylerad adapter. DNA-strängen används sedan som mall av ett DNA-polymeras som producerar den komplementära strängen. Därefter ligeras en andra adapter vid 3'-änden av den komplementära strängen och hela konstruktionen amplifieras genom PCR och sekvenseras sedan. Reningssteget utförs med användning av streptavidin -belagda paramagnetiska pärlor som möjliggör minimering av DNA-förlusten under denna fas av proceduren.

Anrikande bibliotek för aDNA

Olika metoder (kallade anrikningsmetoder) har utvecklats för att förbättra tillgängligheten till endogent DNA i fornlämningar. Dessa tillvägagångssätt kan huvudsakligen delas in i tre typer: de som används under bibliotekskonstruktion, genom att företrädesvis införliva aDNA-fragment som kännetecknas av den höga nivån av skada, de som tillämpas efter bibliotekskonstruktion, genom att separera exogena och endogena fraktioner genom hybridisering till fördefinierade uppsättningar av sönder (i lösning eller på mikroarrayer ), eller de som är baserade på riktad nedbrytning av mikrobiellt DNA från miljön med användning av restriktionsenzymer och primerextension capture (PEC).

Selektiv uracilberikning

Under konstruktionen av biblioteket binds ssDNA-fragmenten genom en biotinylerad adapter till streptavidin-belagda pärlor. I polymerasförlängningssteget genereras den DNA-sträng som är komplementär till den ursprungliga mallen. Vid denna typ av anrikning genomgår konstruktionerna fosforylering vid 5'-änden, för att möjliggöra ligering av en icke-fosforylerad adapter (ligering mellan 3'-änden av adaptern och 5'-änden av den nyligen syntetiserade strängen). DNA behandlas sedan med uracil-DNA-glykosylas (UDG) och endonukleas VIII (ANVÄNDARmix): UDG genererar abasiska ställen vid cytosin som deaminerades till uraciler post mortem, endo VIII skärsår vid det resulterande abasiska stället. Denna klyvning genererar nya 3'-terminaler, som sedan defosforyleras, vilket resulterar i 3'OH-ändar som kan användas som startpunkter för ett nytt steg av förlängning. Detta resulterar i förlängning av den skadade strängen, från den skadade regionen mot den avgränsade kulan: medan den nya DNA-molekylen syntetiseras, förskjuts det ursprungliga fragmentet. Som ett resultat innehåller de nybildade dsDNA-molekylerna inte längre adaptern bunden till pärlorna, vilket i supernatanten lämnar ett dsDNA-bibliotek av strängarna som ursprungligen hyste deaminerade cytosiner, tillgängliga för ytterligare amplifiering och sekvensering. Den oskadade DNA-mallfraktionen förblir fäst vid de paramagnetiska pärlorna.

Förlängningsfri målanrikning i lösning

Detta tillvägagångssätt är baserat på i lösning mål-sond hybridisering för att screena för endast en enda mikroorganism, efter konstruktionen av biblioteket. Det är en artspecifik analys som kräver värmedenaturering av DNA-bibliotek och konstruktion av ett sond-DNA-bibliotek med långvägs-PCR om färskt DNA-material från närbesläktade arter är tillgängligt, eller genom anpassad design och syntes av oligonukleotider . Denna metod är användbar när den mikroorganism som ska riktas mot är känd, till exempel när hypotesen existerar för det orsakande medlet för en epidemi eller i närvaro av skelettskador hos de studerade individerna.

Fastfas målanrikning

En annan berikande strategi som tillämpas efter att biblioteket byggts är direkt tillämpning av mikromatriser . De används för en bred laboratoriebaserad patogenscreening som samtidigt söker efter olika patogena mikroorganismer. Denna typ av tillvägagångssätt är gynnsamt för de patogener som inte lämnar några fysiska skelettbevis och vars närvaro inte lätt kan antas på förhand . Proberna är designade för att representera konserverade eller unika regioner från en rad patogena virus, parasiter eller bakterier.

Eftersom mikroarrayer innehåller sekvenser som härrör från moderna stammar av antika patogener, är gränserna för denna metod den dåliga upptäckten av de mest divergerande genomiska regionerna och utelämnandet av regioner med viktiga genomiska omarrangemang eller okända ytterligare plasmider .

Helgenomberikning

Infångningen av hela genomet i lösning (WISC) möjliggör karakterisering av hela genomsekvensen hos forntida individer. Denna teknik är baserad på användningen av ett genomomfattande biotinylerat RNA-probbibliotek genererat genom in vitro -transkription av färska moderna DNA-extrakt från arter som är nära besläktade med mål-aDNA-provet. Det värmedenaturerade aDNA-biblioteket hybridiseras sedan till RNA-proberna. För att förbättra stringens och minska anrikning för mycket repetitiva regioner, tillsätts lågkomplexitets-DNA och adaptorblockerande RNA-oligonukleotider. Biblioteksfraktionen av intresse utvanns sedan genom eluering från streptavidinbelagda paramagnetiska pärlor (till vilka RNA-sonderna är bundna).

Beräkningsanalys

Analysen av sekvensdata som erhållits av NGS bygger på samma beräkningsmetoder som används för modernt DNA, med vissa egenheter. Ett allmänt använt verktyg för att anpassa läsningar från aDNA mot referensgenom är PALEOMIX-paketet, som kan kvantifiera DNA-skadenivåer genom mapDamage2 och utföra fylogenomiska och metagenomiska analyser. Det är viktigt att tänka på att anpassningen alltid kommer att uppvisa väsentliga fraktioner av nukleotider som inte matchar varandra som inte är ett resultat av sekvenseringsfel eller polymorfismer utan från närvaron av skadade baser. Av denna anledning bör acceptanströskeln för läs-till-referensredigeringsavstånd väljas enligt det fylogenetiska avståndet till referensgenomet. Probabilistiska aligners som tar hänsyn till skademönstret för aDNA har utvecklats för att förbättra anpassningar.

MALT

Studier av patogeners uråldriga DNA är begränsade till skelettsamlingar som ändrar sitt utseende till följd av infektioner. En patogen kopplad till ett känt epidemiologiskt sammanhang identifieras genom screening utan förkunskap om dess förekomst. Metoder inkluderar bredspektrummolekylära tillvägagångssätt fokuserade på patogendetektion via fluorescenshybridiseringsbaserad mikroarrayteknologi, identifiering via DNA-anrikning av vissa mikrobiella regioner eller beräkningsscreening av icke-berikade sekvensdata mot humana mikrobiomdatauppsättningar . Dessa tillvägagångssätt erbjuder förbättringar men förblir partiska i de bakteriella taxa som används för tilldelningar på artnivå.

MEGAN alignment tool (MALT) är ett nytt program för den snabba anpassningen och taxonomiska tilldelningsmetoden för identifiering av gammalt DNA. MALT liknar BLAST eftersom det beräknar lokala anpassningar mellan mycket konserverade sekvenser och referenser. MALT kan också beräkna halvglobala justeringar där läsningar är justerade ände till ände. Alla referenser, kompletta bakteriegenom, finns i en databas som heter National Center for Biotechnology Information (NCBI) RefSeq. MALT består av två program: maltbyggd och maltdriven. Malt-build används för att konstruera ett index för den givna databasen med referenssekvenser. Istället används malt-run för att anpassa en uppsättning frågesekvenser mot referensdatabasen. Programmet beräknar sedan bitpoängen och det förväntade värdet (E-värdet) för justeringen och bestämmer om justeringen ska behållas eller förkastas beroende på användarspecificerade trösklar för bitpoängen, E-värdet eller procentidentiteten . Bitpoängen är den nödvändiga storleken på en sekvensdatabas där den aktuella matchningen kunde hittas av en slump. Ju högre bitpoäng, desto bättre sekvenslikhet. E-värde är antalet förväntade träffar av liknande kvalitet (poäng) som kan hittas av en slump. Ju mindre E-värdet är, desto bättre är matchningen.

MALT tillåter screening av icke-berikade sekvensdata i sökandet efter okända kandidatbakteriepatogener som är involverade i tidigare sjukdomsutbrott och för att utesluta den miljömässiga bakteriella bakgrunden. MALT är mycket viktigt eftersom det erbjuder fördelen med screening på genomnivå utan urval av en viss målorganism, vilket undviker fel som är gemensamma för andra screeningmetoder. För att autentisera de taxonomiska kandidattilldelningarna krävs fullständiga anpassningar, men mål-DNA:t är ofta närvarande i en låg mängd så ett litet antal av en markerad region kanske inte är tillräcklig för identifiering. Detta tillvägagångssätt kan endast detektera bakteriellt DNA och viralt DNA, så det är inte möjligt att identifiera andra smittämnen som kan finnas i en population. Denna metod är användbar för studier som handlar om identifiering av patogener som är ansvariga för forntida och moderna sjukdomar, särskilt i fall där kandidatorganismer inte är kända a priori .

Ansökningar

Forntida patogengenomik som ett verktyg mot framtida epidemier

En intressant tillämpning av de olika sekvenseringsteknikerna som finns tillgängliga nuförtiden är undersökningen av historiska sjukdomsutbrott för att ge svar på viktiga och långvariga frågor inom epidemiologi, patogenevolution och även mänsklig historia.

Så mycket ansträngning läggs ner på att hitta mer och mer information om etiologin för infektionssjukdomar av historisk betydelse, såsom pest och cocoliztli-epidemin, för att beskriva den geografiska spridningen av virus och för att försöka definiera den patogena mekanismen för dessa infektionsämnen som är faktiskt aktiva delar av evolutionsprocessen. Idag Y.pestis och S. enterica vara ofarliga för människor, men forskare är fortfarande intresserade av den långsiktiga spårningen av genetisk anpassning av dessa bakterier och exakt kvantifiering av hastigheten för deras evolutionära förändring. Detta beror på att de från denna kunskap om det förflutna kan utvinna rätt idéer för att utveckla en strategi mot framtida epidemier.

Att vara fullständigt medveten om det faktum att bakterier och virus är ett av de mest varierande elementen i naturen, benägna till obegränsade mutationshändelser, och tar för givet att det är omöjligt att hantera alla externa faktorer som kan påverka utvecklingen av ett patogent virus, ingen talar om att besegra ett nytt möjligt utbrott av pest eller något annat smittämne från det förflutna: här är målet att definiera en strategi, en "riktlinje", för att vara mer förberedd när en ny farlig patogen kommer. Miljöns bidrag till infektioner ska definieras och faktorer som mänsklig migration, klimatförändringar, överbefolkning i städer eller djurtämjning är några av de viktigaste orsakerna som bidrar till uppkomsten och spridningen av sjukdomar. Naturligtvis är dessa faktorer oförutsägbara och detta är en anledning till att forskare försöker ta fram relevant information från det förflutna, som kan vara användbar, idag och imorgon. Medan de fortsätter att utveckla strategier för att besegra framväxande hot med hjälp av diagnostiska, molekylära och avancerade verktyg, ser de fortfarande tillbaka på hur forntida patogener har utvecklats och anpassats genom historiska händelser. Ju mer det är känt om den genomiska grunden för virulens i historiska sjukdomar, desto mer kan det förstås om uppkomsten och återuppkomsten av infektionssjukdomar idag och i framtiden.

Forntida infektioner och mänsklig evolution

Analyserna av fylogena samband mellan den mänskliga värden och virala patogener tyder på att många sjukdomar har utvecklats tillsammans med människor i årtusenden, sedan början av mänsklighetens historia i Afrika.

I synnerhet anses den långsiktiga interaktionen med patogener vara ett urval som kan vara mycket starkt eftersom inte alla individer kunde överleva i kontakt med alla smittämnen som de hade träffat under åren: det naturliga urvalet av patogener är inblandat i evolutionen av arter. Denna interaktion har redan använts för att spåra mänskliga befolkningsrörelser och för att rekonstruera mänskliga migrationsströmmar inom och ut ur Afrika.

En ganska ny tillämpning och tolkning av denna funktion är att använda aDNA för att bättre förstå mänsklig evolution. Många tropiska infektioner spelade förmodligen en betydande roll i människans evolutionära process. Korrelationen mellan människor och virus kan förstås om det ses som en "kamp" som fortsätter i årtusenden och som fortfarande inte vinner någon: när virus har ändrat sina egenskaper för att vara smittsamma för de andra "fighters", människor var tvungna att hitta en strategi för att öka sin kondition och överlevde bland förändringar.

I denna kontinuerliga utmaning genom åren, bredvid infektionssjukdomar och andra sjukdomar som drabbar det moderna mänskliga samhället, representerar cancer nyligen en av de mest gåtfulla åkommorna. Forskare undersöker om neoplastiska sjukdomar är begränsade till det postindustriella mänskliga samhället eller om deras ursprung kan hittas längre tillbaka i tiden, kanske in i förhistorien. Svårigheten är att cancer, dödlig och snabb, lämnar mycket få indikationer i skelett i de fall som dukar under till döden inom kort, och till och med inga tecken på existens alls, i fallet med extraskelettala tumörer. Hur som helst, kunskapen om cancer etiologin är ofullständig och mikroorganismer tar sin del i rollen av sin infektion: migrationsrörelser i det förflutna kunde ha fört med sig virus, så en möjlig reservoar av tropiska sjukdomar samt predisposition för cancer. Av denna anledning tillämpas molekylära analytiska tekniker på arkeologiska lämningar för att studera hominins evolution, men också för att förbättra forskningen för att förstå tumörers epidemiologi och etiologi. Information som härrör från aDNA kan användas för att förankra patogenmutationer och rekonstruera tillbaka från närvaron av mikroorganismer den evolutionära processen, det kan vara användbart att utveckla nya vacciner eller för att upptäcka möjliga framtida patogena hot.

Tidigare pandemier är mycket mer än bara antik historia

Det som hände i det förflutna är inte bara historia, det finns något dolt som fortfarande kan driva mänsklig genetisk mångfald och naturligt urval, något som kom i kontakt med mänskligheten för hundratals år sedan men som fortfarande kan ha en inverkan på den globala mänskliga hälsan. Eftersom epidemier är ett av de vanligaste fenomenen som har påverkat och potentiellt ödelagt mänskliga populationer, är det viktigt att upptäcka, förebygga och kontrollera potentiella smittämnen. När allt kommer omkring är arkeologer, genetiker och medicinska forskare angelägna om att utforska påverkan av patogener som kan bidra, hota eller förbättra människors hälsa och livslängd.

Evolution och fylogenes av Yersinia pestis

Yersinia pestis är en gramnegativ bakterie och tillhör familjen Enterobatteriaceae. Dess närmaste släktingar är Yersinia pseudotuberculosis och Yersinia enterocolitica , som är miljöarter.

Y. pestis bacill.

De har alla plasmiden pCD1, som kodar för ett sekretoriskt system av typ III. Bland kromosomala proteinkodande gener är deras nukleotidgenomiska identitet 97 %. De är olika vad gäller deras virulenspotential och överföringsmekanismer.

Y. pestis är inte en mänskligt anpassad bakterie. Dess huvudsakliga reservoarer är gnagare (som murmeldjur, möss, gerbiler, sorkar och präriehundar) och det överförs till människor av loppan . En av de mest studerade vektorerna för denna patogen är Xenopsylla cheopis .

Efter bett av en infekterad loppa går bakterierna in i värdorganismen och reser till den närmaste lymfkörteln, där bakterier replikerar och orsakar de stora svullnaderna som kallas buboer. Bakterier kan också spridas in i blodomloppet (orsakar septikemi) och till lungan (orsakar lunginflammation). Lungsjukdomen har en direkt överföring från människa till människa.

Det har fastställts att Y. pestis blev så farlig på grund av förvärvet av ymt (yersina murint toxin). Denna gen finns på pMT1-plasmiden och möjliggjorde överlevnaden av bakterien i loppvektorn och underlättade kolonisering av mellantarmen hos leddjur, vilket gav upphov till det senaste årtusendet i storskaliga pandemier.

Tidig evolution och divergens från Yersinia pseudotuberculosis

Y. pestis kan skiljas från de andra två arterna på grund av dess patogenicitet och överföringsmekanism. Dessa skillnader ges av två plasmider: pPCP1, som ger bakterien dess invasiva egenskaper hos människor och pMT1, som är involverat i loppkolonisering (tillsammans med viss funktionsförlust på bakteriella kromosomala gener).

Prover daterade från sen neolitikum och bronsåldern gjorde det möjligt att identifiera en första genetisk divergens mellan Y. pseudotuberculosis och Y. pestis förfäder. De egenskaper som ger Y. pestis dess virulens saknades i dessa stammar: de saknar ymt , en gen som är nödvändig för koloniseringen av vektorn; de presenterade också en aktiv form av gener som krävs för biofilmbildning (inaktiv i patogenen Y. pestis ) och en aktiv flagellingen , som är en inducerare av immunsvar (är en pseudogen i Y. pestis ).

Jämförelsen av ett utkast av genomet och de två plasmiderna (pCD1 och pMT1) med prover av svarta dödens offer (1348-1349) på begravningsplatsen i East Smithfield underströk en mycket hög genetisk bevarande av sekvensen: endast 97 enkelnukleotidskillnader över 660 år.

Y. pestis mikroevolution

Den individuella stammen London 6330 äger mutationer som saknas i andra isolat från samma period (1348-1350): orsaken kan antingen vara närvaron av flera stammar som cirkulerar i Europa samtidigt eller mikroevolutionen av en enda stam under pandemin.

Tre stora utbrott av pest

Det finns tre pandemiutbrott av Y. Pestis :

1. Den första är känd som Justinianus plåga, den inträffade först i Egypten 541-543 och spred sig sedan till Konstantinopel och närliggande regioner. Det hade utbrott i Europa fram till 750 e.Kr. Fylogenetisk analys visade att båda genomen tillhör en härstamning som är utdöd idag och är nära besläktad med fläckar från dagens Kina, vilket tyder på möjligheten till ett östasiatiskt ursprung till den första pandemin.
2. Den andra pandemin är känd som digerdöden eller som stor pest. Den inträffade 1346-1352 i Europa och hade många återuppkomster av pest, den fortsatte fram till 1700-talet. Det kan vara möjligt att det i denna pandemi fanns två olika stammar av Y. pestis som kom in på kontinenten genom olika pulser.
3. Den tredje pandemin startade i Kina 1860. Den har en snabb spridning till andra länder, på grund av användningen av järnvägar och ångfartyg.

Stammarna associerade med Justinian-pesten förekommer på en ny gren, som är fylogenetiskt skild från den andra och den tredje pestens pandemi. Den första stammen av Y. pestis som hittades under det andra utbrottet överlever och ger upphov till moderna gren 1-stammar associerade med det tredje pandemiutbrottet.

Den första pestbakterien och den andra och tredje peststammen har en gemensam förfader.

Koppling mellan 2:a och 3:e pandemin

återupptogs genom av Y. pestis från tre prover i Barcelona (död mellan 1300-1420), Ellwangen (mellan 1486-1627) och Bolgar city (mellan 1298-1388). Dödsdatumet för de analyserade individerna bestämdes tack vare radiokoldatum ; det sista bekräftades av närvaron av ett mynt som producerats först efter år 1362. Av 223 prover från 178 individer hade endast ett för varje plats en lämplig mängd DNA och valdes slutligen ut för hela genomsekvenseringen av bacillen (genom en genominfångningsanalys, som använder som ett utkast av Y. pseudotuberculosis- genom och pMT1 och pCD1 från Y. pestis ).

Anpassningen med ett Y. pestis fylogeniträd skapat med tidigare kända forntida genom avslöjade en ökad genetisk mångfald utanför Kina i jämförelse med vad man tidigare trodde; alla de tre nya genomen som kartlagts i gren 1 och har två SNP: er associerade med Svartedöden (alla genomen från Y. pestis daterade till Svartedöden-kartan i Gren 1). Barcelona-stammen har inga skillnader med London-stammen; de två individerna från vilka genomet erhölls dog av pest med ett avstånd på några månader (våren och hösten 1348), vilket understryker förekomsten i Europa av en enda våg av pest med låg genetisk mångfald. Ellwangen-stammen kartläggs i en undergren av gren 1 och är förfäder till en tidigare sekvenserad stam (L'Observance). den härstammar från den som cirkulerade i London och Barcelona under digerdöden men har också ytterligare mutationer. Anses därför vara en släktlinje som avvikit från gren 1 före 1500-talet (Ellwangens utbrott) och utan kända moderna ättlingar.

I jämförelse med isolat från digerdöden presenterar staden Bolgar:

• p3 och p4, delade av "London-individen 6330";
• p6, delad med alla moderna Branch 1-stammar;
• p7, unik för denna stam;

Bolgar City-stammen har SNP:er associerade med digerdöden och kan vara ett bevis på en peströrelse mot öst; Dessa fynd ger kredit till en av modellerna som försöker förklara kopplingen mellan 2:a och 3:e pandemin: i detta scenario fanns det en enda pestutgång till Europa (som orsakade digerdöden) som efter en strålningshändelse reste österut för att fastställa i före detta sovjetunionen och Asien, varifrån den spred sig på 1700-talet för att ge upphov till den tredje pandemin.

En annan hypotes är att den tredje pandemins härstamning kan ha genererats av en redan existerande genetisk variation i Y. pestis- stammar i Kina: denna hypotes stöds faktiskt av korrelationen mellan följande vågor av pandemin i Europa och klimatfluktuationer som skulle ha tillåtit dess spridning på kontinenten. Denna modell kan inte förklara den genetiska mångfalden av digerdöden (åtminstone fyra olika linjer, som skulle ha krävt introduktionen från Asien av fyra olika stammar).

Återigen finns det två modeller som försöker förklara de många pestutbrotten i Europa efter den svarta döden:

• Upprepad introduktion av pest från Asien. Detta scenario är kompatibelt med den andra teorin som diskuterats tidigare som ser en genetisk variation av Y. pestis i Kina;
• Närvaro i Europa av en reservoar (nu utdöd) som orsakade fortsatta utbrott fram till 1700-talet;

Båda modellerna kan vara giltiga och nuförtiden kan vi inte demonstrera den ena framför den andra. Emellertid kan Ellwangen-stammens genom som sekvenseras i denna studie anses vara ett bevis på den andra hypotesen på grund av stadens geografiska position som tenderar att utesluta möjligheten av en introduktion av pest från öster.

Moderna Y. pestis -stammar

Sekvensering av Y. pestis -genom gjorde det möjligt att upptäcka en variationshändelse som föregick digerdöden som gav upphov till många stammar som cirkulerar idag.

Analys av genoms av Salmonella enterica

En serie 16:e epidemier i Mexiko, kallad " huey cocoliztli " på det inhemska Nahuatl-språket, orsakade hög dödlighet i den inhemska aztekiska befolkningen, vilket ledde till demografisk kollaps. Dessa epidemier anses vara bland de värsta epidemierna i Mexikos historia och orsakerna har förblivit ett mysterium i över 500 år.

En grupp forskare från Harvard och Max-Planck Institute publicerade en studie i tidskriften Nature ecology and Evolution , och de föreslår Salmonella enterica som en bra kandidat för den starka epidemin i Mexiko under 1500-talet. Många studier tyder på att denna bakterie har introducerats i ursprungsbefolkningen av européer.

Gruppen av forskare analyserade aDNA extraherat från tänderna på 24 skelett begravda på en kyrkogård i staden Teposcolula-Yucundaa och de hittade i 10 av de 24 skelett aDNA-spår av Salmonella enterica . Dessutom, för att visa att bakterien introducerades i Mexiko av européerna, analyserade de fem individer som begravdes innan tillströmningen av européer. Resultaten avslöjade att det inte fanns några bevis för Salmonella enterica under tiden före kontakten .

Analys av Salmonella enterica -genom

Forskarna utförde extraktion av aDNA från tänderna på 24 inhemska individers kvarlevor från kontakterans epidemikyrkogård och av 5 individer begravda på kyrkogården före kontakttiden. Extraktionen utfördes enligt protokollet för aDNA-extraktion. Forskargruppen undersökte, parallellt, även ett jordprov av kyrkogårdarna för att få en överblick över miljöns mikroorganismer som kunde ha trängt in i proverna.

Efter extraktionen sekvenserades genomen med hjälp av Illumina genomanalysator. Sedan, med hjälp av ett bioinformatiskt verktyg, kallat MALT, utförde forskarna en analys av metagenomiska sekvensdata. Detta program låter forskarna anpassa de extraherade sekvenserna med en referens utan att ange ett exakt mål. Forskarna utförde MALT-körning två gånger: en med de fullständiga bakteriegenom som var tillgängliga via NCBI (National Center for Biotechnology Information) RefSeq som referens, och den andra körningen utfördes med hjälp av hela NCBI-nukleotiddatabasen för att screena för viralt DNA.

Resultatet av screeningprocessen var positivt för närvaron av Salmonella enterica DNA i 10 sekvenser upp till 24 insamlade från proverna och tretandsprov hade en hög mängd avläsningar tilldelade S. enterica . I synnerhet är den huvudsakliga S. enterica -stammen som finns i proverna S. Paratyphi C. Denna stam orsakar enterisk feber hos mänskliga individer. I proverna före kontakttiden fann de inga bevis för S. enterica , vilket stöder hypotesen att S. enterica inte var en lokal bakterie.

En ytterligare analys utfördes för att identifiera det klassiska mönstret av skada av aDNA i de tre positiva tandproverna och detta utfördes genom att kartlägga datamängderna till S. Paratyphy C-genomreferensen. Resultaten var positiva och stödde tesen om S.enterica som orsaken till cocolitzli.

För att gå på djupet med analyserna och bekräfta tesen genomförde forskarna ytterligare experiment och beräkningsanalys. De utförde en hel-genom-målarray och hybridiseringsfångning i lösning med hjälp av prober som inkluderar de moderna S. enterica -genomskillnaderna och med användning av S . Paratyphi C som referens. Hybridiseringen var framgångsrik för de tio positiva proverna, medan de andra proverna resulterade negativt för det gamla DNA:t.

Se även

• aDNA
• Yersinia pestis
• Salmonella enterica
• DNA mikroarray
• DNA-bibliotek
• NGS