Hybridiseringsanalys
En hybridiseringsanalys omfattar vilken form som helst av kvantifierbar hybridisering, dvs. den kvantitativa hybridiseringen av två komplementära strängar av nukleinsyror , känd som nukleinsyrahybridisering .
Översikt
I samband med biokemi och läkemedelsutveckling är en hybridiseringsanalys en typ av Ligand Binding Assay (LBA) som används för att kvantifiera nukleinsyror i biologiska matriser. Hybridiseringsanalyser kan vara i lösning eller på ett fast underlag såsom plattor med 96 brunnar eller märkta pärlor.
Hybridiseringsanalyser involverar märkta nukleinsyrasonder för att identifiera relaterade DNA- eller RNA- molekyler (dvs. med signifikant hög grad av sekvenslikhet) inom en komplex blandning av omärkta nukleinsyramolekyler . Antisensterapi , siRNA och andra oligonukleotid- och nukleinsyrabaserade bioterapeutika kan kvantifieras med hybridiseringsanalyser.
Signalering av hybridiseringsmetoder kan utföras med användning av oligonukleotidsonder modifierade i syntes med haptener och småmolekylära ligander som verkar homologt med infångnings- och detektionsantikropparna. Som med traditionell ELISA kan konjugat till pepparrotsperoxidas (HRP) eller alkaliskt fosfatas (AP) användas som sekundära antikroppar.
Sandwichhybridiseringsanalys
I sandwich-hybridiserings- ELISA -analysformatet ersätts antigenliganden och antikropparna i ELISA med en nukleinsyraanalyt, komplementära oligonukleotidfångnings- och detektionsprober.
Generellt, när det gäller nukleinsyrahybridisering, kontrolleras monovalent saltkoncentration och temperatur för hybridisering och tvättstringens, i motsats till en traditionell ELISA, där saltkoncentrationen vanligtvis kommer att fixeras för bindnings- och tvättstegen (dvs. PBS eller TBS). Således varierar optimal saltkoncentration i hybridiseringsanalyser beroende på längden och bassammansättningen av analyten, infångnings- och detektionssonderna.
Kompetitiv hybridiseringsanalys
Den kompetitiva hybridiseringsanalysen liknar en traditionell kompetitiv immunanalys . Liksom andra hybridiseringsanalyser förlitar den sig på komplementaritet, där infångningsproben tävlar mellan analyten och spårämnet - en märkt oligonukleotidanalog till analyten.
Hybridisering-ligeringsanalys
I hybridiserings-ligeringsanalysen ersätter en mallprob infångningsproben i sandwichanalysen för immobilisering till det fasta underlaget. Mallsonden är helt komplementär till oligonukleotidanalyten och är avsedd att tjäna som ett substrat för T4 DNA-ligasförmedlad ligering. Templatproben har dessutom en ytterligare sträckning som är komplementär till en ligeringsprob så att ligeringsproben kommer att ligera till 3'-änden av analyten. Även om den är generisk liknar ligeringsproben en detektionssond genom att den är märkt med till exempel digoxigenin för nedströmssignalering. Stringent tvätt med låg/inget salt tar bort oligerade produkter.
Ligeringen av analyten till ligeringsproben gör metoden specifik för 3'-änden av analyten, ligering med T4 DNA-ligas är mycket mindre effektiv över en utbuktning, vilket skulle hända för en 3'-metabolit N-1-version av analyten, till exempel. Specificiteten för hybridiserings-ligeringsanalysen för ligering vid 3'-änden är särskilt relevant eftersom de dominerande nukleaserna i blod är 3'- till 5'- exonukleaser .
En begränsning av metoden är att den kräver en fri 3'-ände hydroxyl som kanske inte är tillgänglig när målgruppsdelar är fästa till 3'-änden, till exempel. Vidare kan mer exotiska nukleinsyrakemier med oligonukleotidläkemedel påverka aktiviteten av ligaset, vilket måste bestämmas från fall till fall.
Dubbelligeringshybridiseringsanalys
Dubbelligeringshybridiseringsanalysen (DLA) utökar specificiteten för hybridiseringsligeringsanalysen till en specifik metod för moderföreningen. Trots hybridiseringsligeringsanalysens robusthet, känslighet och tillförda specificitet för 3'-änden av oligonkuleotidanalyten, är hybridiseringsligeringsanalysen inte specifik för 5'-änden av analyten.
DLA är endast avsett att kvantifiera fullängds moderoligonukleotidföreningen, med både intakta 5'- och 3'-ändar. DLA-sonder ligeras vid 5'- och 3'-ändarna av analyten genom den gemensamma verkan av T4 DNA-ligas och T4-polynukleotidkinas . Kinaset fosforylerar 5'-änden av analyten och ligaset kommer att förena infångningssonden med analyten till detektionssonden. Infångnings- och detektionssonderna i DLA kan sålunda benämnas ligeringssonder. När det gäller hybridiseringsligeringsanalysen är DLA specifik för moderföreningen eftersom effektiviteten av ligeringen över en utbuktning är låg, och sålunda detekterar DLA analyten av full längd med både intakta 5'- och 3'-ändar. DLA kan också användas för bestämning av individuella metaboliter i biologiska matriser.
Begränsningarna med hybridiserings-ligeringsanalysen gäller även för dubbelligeringsanalysen, där 5'-änden förutom 3'-änden kräver att ha en fri hydroxyl (eller en fosfatgrupp). Vidare är T4 DNA-ligaser inkompatibla med ligering av RNA-molekyler som donator (dvs RNA vid 5'-änden av ligeringen). Därför kanske andra generationens antisense som innefattar 2'-O-metyl-RNA, 2'-O-metoxietyl eller låsta nukleinsyror inte är kompatibel med dubbelligeringsanalysen.
Nukleashybridiseringsanalys
Nukleashybridiseringsanalysen, även kallad S1- nukleasskärningsanalys, är en nukleasskyddsanalysbaserad hybridiserings-ELISA. Analysen använder S1 nukleas , som bryter ned enkelsträngat DNA och RNA till oligo- eller mononukleotider, vilket lämnar intakt dubbelsträngat DNA och RNA.
I nukleashybridiseringsanalysen fångas oligonukleotidanalyten på det fasta underlaget såsom en 96-brunnars platta via en helt komplementär skärsond. Efter enzymatisk bearbetning av S1-nukleas, hybridiseras den fria skärsonden och skärsonden till metaboliter, dvs. shortmers av analyten bryts ned, vilket gör att signalen endast kan genereras från fullängdsskärningsproben-analytduplex.
Analysen är väl tolerant mot olika kemier, vilket exemplifieras av utvecklingen av en nukleasanalys för morfolino- oligonukleotider.
Denna analysuppsättning kan sakna robusthet och är inte lämplig för validering enligt FDA:s riktlinjer för bioanalytisk metodvalidering . Detta visas genom att det saknas en publicerad metod som har validerats enligt de standarder som anges av FDA för bioanalytiska metoder.