Nick (DNA)
Ett hack är en diskontinuitet i en dubbelsträngad DNA- molekyl där det inte finns någon fosfodiesterbindning mellan intilliggande nukleotider i en sträng , vanligtvis genom skada eller enzymverkan . Nicks tillåter DNA-strängar att vrida sig under replikering och tros också spela en roll i DNA-felmatchningsreparationsmekanismerna som fixar fel på både de ledande och eftersläpande dottersträngarna.
Bildande av hack
Diagrammet visar effekterna av hack på korsande DNA i en vriden plasmid . Nicking kan användas för att skingra energin som hålls uppe av korsande tillstånd. Skårorna tillåter DNA att anta en cirkulär form.
Nickad DNA kan vara resultatet av DNA-skada eller målmedvetna, reglerade biomolekylära reaktioner som utförs i cellen. Under bearbetningen kan DNA hackas genom fysisk klippning, övertorkning eller enzymer. Överdriven grov hantering vid pipettering eller vortexning skapar fysisk stress som kan leda till brott och hack i DNA. Övertorkning av DNA kan också bryta fosfodiesterbindningen i DNA och resultera i hack. Nicking-endonukleasenzymer kan hjälpa till med denna process. Ett enkelsträngat brott (nick) i DNA kan bildas genom hydrolys och efterföljande avlägsnande av en fosfatgrupp i den spiralformade ryggraden. Detta leder till en annan DNA-konformation, där en vätebindning bildas i stället för den saknade delen av DNA-ryggraden för att bevara strukturen.
Reparation av hack
Ligaser är mångsidiga och allestädes närvarande enzymer som förenar 3'-hydroxyl- och 5'-fosfatändarna för att bilda en fosfodiesterbindning, vilket gör dem väsentliga för reparering av hackad DNA och slutligen genomtrohet. Denna biologiska roll har också varit extremt värdefull för att försegla de klibbiga ändarna av plasmider vid molekylär kloning. Deras betydelse intygas av det faktum att de flesta organismer har flera ligaser dedikerade till specifika vägar för att reparera DNA. I eubakterier drivs dessa ligaser av NAD+ snarare än ATP. Varje nickplats kräver 1 ATP eller 1 NAD+ för att driva ligasreparationen.
För att sammanfoga dessa fragment, fortskrider ligaset genom tre steg:
- Tillsats av en adenosinmonofosfatgrupp (AMP) till enzymet, kallad adenylylering,
- Adenosinmonofosfatöverföring till DNA och
- Nickförsegling eller fosfodiesterbindning.
Ett speciellt exempel på en ligas-katalyserande nick-förslutning är det E. coli NAD+-beroende DNA-ligaset, LigA. LigA är ett relevant exempel eftersom det strukturellt liknar en kladd av enzymer som finns i alla typer av bakterier.
Ligaser har ett metallbindningsställe som kan känna igen hack i DNA. Ligaset bildar ett DNA-adenylatkomplex som underlättar igenkänning. Med humant DNA-ligas bildar detta ett kristalliserat komplex. Komplexet, som har en DNA-adenylat-mellanprodukt, tillåter DNA-ligas I att inleda en konformationsförändring i DNA:t för isolering och efterföljande reparation av DNA-nicket.
Biologiska implikationer
Roll i missmatch reparation
Enkelsträngade hack fungerar som igenkännbara markörer för att hjälpa reparationsmaskineriet att skilja den nyligen syntetiserade strängen (dottersträngen) från mallsträngen (föräldrasträngen). DNA-felmatchningsreparation (MMR) är ett viktigt DNA-reparationssystem som hjälper till att upprätthålla genomets plasticitet genom att korrigera felmatchningar, eller icke Watson-Crick-baspar i en DNA-duplex. Vissa källor till felaktiga baspar inkluderar replikationsfel och deaminering av 5-metylcytosin-DNA för att bilda tymin. MMR i de flesta bakterier och eukaryoter riktas mot den felaktiga strängen av den felaktiga duplexen genom igenkänning av strängdiskontinuiteter, medan MMR i E. coli och närbesläktade bakterier riktas mot strängen på grundval av frånvaron av metylering . Nicking-endonukleaser introducerar strängdiskontinuiteter, eller DNA-nicks, för båda respektive system. Mut L-homologer från eukaryoter och de flesta bakterier inciserar den diskontinuerliga strängen för att introducera ingångs- eller termineringspunkten för excisionsreaktionen. På liknande sätt, i E. coli, hackar Mut H den ometylerade strängen av duplexet för att introducera ingångspunkten för excision. Specifikt för eukaryoter skiljer sig mekanismen för DNA-replikationsförlängning mellan den ledande och eftersläpande strängen. På den eftersläpande strängen finns hack mellan Okazaki-fragment och är lätta att känna igen av DNA-felparningsreparationsmaskineriet före ligering . På grund av den kontinuerliga replikeringen som sker på den ledande strängen är mekanismen där något mer komplex. Under replikering tillsätts ribonukleotider av replikationsenzymer och dessa ribonukleotider hackas av ett enzym som kallas RNase H2 . Tillsammans gör närvaron av ett hack och en ribonukleotid den ledande strängen lätt att känna igen för reparationsmaskineriet för DNA-felmatchning.
Nick-translation är en biologisk process där ett enkelsträngat DNA-nick fungerar som markör för DNA-polymeras för att skära ut och ersätta eventuellt skadade nukleotider. I slutet av segmentet som DNA-polymeras verkar på DNA-ligas reparera det sista segmentet av DNA-ryggraden för att fullborda reparationsprocessen. I en labbmiljö kan detta användas för att introducera fluorescerande eller andra taggade nukleotider genom att målmedvetet inducera platsspecifika, enkelsträngade hack i DNA in vitro och sedan lägga till det hackade DNA till en miljö rik på DNA-polymeras och taggad nukleotid. DNA-polymeraset ersätter sedan DNA-nukleotiderna med de märkta, med början vid platsen för det enkelsträngade hacket.
Roll i replikering och transkription
Nicked DNA spelar en viktig roll i många biologiska funktioner. Till exempel kan enkelsträngade hack i DNA fungera som ändamålsenliga biologiska markörer för enzymet topoisomeras som lindar upp packat DNA och är avgörande för DNA-replikation och transkription. I dessa fall är hackat DNA inte resultatet av oönskad cellskada.
Topoisomeras-1 verkar företrädesvis vid hack i DNA för att klyva intill hacket och sedan lindar eller lindar upp de komplexa topologier som är associerade med packat DNA. Här fungerar hacket i DNA:t som en markör för enkelsträngsbrott och efterföljande avlindning. Det är möjligt att detta inte är en mycket konserverad process. Topoisomeras kan orsaka korta deletioner när det klyver bindningar, eftersom både fullängds DNA-produkter och korta deletionssträngar ses som produkter av topoisomerasklyvning medan inaktiva mutanter endast producerade fullängds DNA-strängar.
Nicks i DNA ger också upphov till olika strukturella egenskaper, kan vara involverade i att reparera skador orsakade av ultraviolett strålning och används i de primära stegen som möjliggör genetisk rekombination .
Nick tomgång är en biologisk process där DNA-polymeras kan bromsa eller stoppa dess aktivitet att lägga till baser till en ny dottersträng under DNA-replikation vid ett hackställe. Detta är särskilt relevant för Okazaki-fragment i eftersläpande sträng i dubbelsträngad DNA-replikation eftersom replikationsriktningen är motsatt riktningen för DNA-polymeras , därför spelar nick tomgång en roll för att stoppa komplexet eftersom det replikerar i omvänd riktning i små fragment ( Okazaki-fragment) och måste stoppa och placera om sig själv mellan varje fragmentlängd av DNA.
DNA-strukturen förändras när ett enkelsträngat hack introduceras. Stabiliteten minskar eftersom ett brott i fosfodiester-ryggraden tillåter DNA att varva ner , eftersom den uppbyggda stressen från vridning och packning inte motsätts lika starkt längre. Nicked DNA är mer mottagligt för nedbrytning på grund av denna minskade stabilitet.
I bakterier
Nic - stället eller nick-området finns inom ursprunget för överföring ( oriT ) och är en nyckel för att starta bakteriell konjugering . En enkel DNA-sträng, som kallas T-strängen , skärs vid nic av ett enzym som kallas relaxas . Denna enda sträng överförs så småningom till mottagarcellen under processen för bakteriell konjugation . Innan denna klyvning kan ske är det dock nödvändigt för en grupp proteiner att fästa vid oriT- stället. Denna grupp av proteiner kallas relaxosomen. Man tror att delar av oriT- stället böjs på ett sätt som skapar interaktion mellan relaxosomproteinerna och nic -stället.
Klyvning av T-strängen innebär att relaxas skär en fosfodiesterbindning vid nic-stället. Den klyvda strängen lämnas med en hydroxylgrupp vid 3'-änden, vilket kan göra det möjligt för strängen att bilda en cirkulär plasmid efter att ha flyttats in i mottagarcellen.