Chymopapain
| Chymopapain | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Chymopapains struktur
| |||||||||
| Identifierare | |||||||||
| EG nr. | 3.4.22.6 | ||||||||
| CAS-nr. | 2593837 | ||||||||
| Databaser | |||||||||
| IntEnz | IntEnz-vy | ||||||||
| BRENDA | BRENDA inträde | ||||||||
| ExPASy | NiceZyme-vy | ||||||||
| KEGG | KEGG inträde | ||||||||
| MetaCyc | Metabolisk väg | ||||||||
| PRIAM | profil | ||||||||
| PDB- strukturer | RCSB PDB PDBe PDB summa | ||||||||
| |||||||||
Chymopapain ( EC 3.4.22.6 , chymopapain A , chymopapain B , chymopapain S , varumärke Chymodiactin ) är ett proteolytiskt enzym isolerat från latexen från papaya ( Carica papaya ). Det är ett cysteinproteas som tillhör gruppen papainliknande proteaser ( PLCP). På grund av dess proteolytiska aktivitet är den huvudmolekylen i processen för kemonukleolys , som används i vissa procedurer som behandling av nedre ländryggsbråck i ryggraden med en icke-kirurgisk metod.
Strukturera
Primär struktur
Chymopapains zymogen består av totalt 352 rester och den har en vikt på cirka 23,78 kDa. Tre olika regioner kan urskiljas inuti prekursorns kedja.
- De första 18 aminosyrorna fungerar som en sorteringssignal genom att indikera slutdestinationen för kymopapain inuti cellen när de sorteras av Golgi-apparaten . Även om denna slutdestination inte är fullständigt studerad ännu, finns andra PLCPs i lysosomer och andra surgjorda vesiklar och chymopapain tros också finnas i samma vesiklar. Det är också känt att kymopapain utsöndras utanför cellen.
- Den andra regionen utgörs av resterna 19 till 134, som överensstämmer med en propeptid som kommer att tas bort vid aktivering när kymopapain når sin slutdestination inuti cellen. Denna region tillåter proteinet att vikas ordentligt i det endoplasmatiska retikulumet och att stabilisera kedjan under olika surhetsförhållanden, eftersom dess optimala pH varierar från 3,5 till 10 beroende på substratet. Därför stöder förmågan att arbeta under låga pH-förhållanden tanken att chymopapain kan hittas i lysosomer . Propeptiden viks på ett sätt som förhindrar substrat från att komma in i det aktiva stället , vilket blockerar proteolytisk aktivitet tills den spjälkas.
- Resten av proteinet - resterna 135 till 352 - överensstämmer med chymopapains mogna kedja . Tre aminosyror kan markeras i denna region, som är Cys159, His293 och Asn313, eftersom de utgör enzymets katalytiska tryad . Cys159 och His293 är de två resterna som utför katalysen av substratet medan Asn313 interagerar med Cys159 och korrekt orienterar sin imidazoliumring för att tillåta reaktionen att ske, och har därmed en viktig funktion i katalysen också.
Sekundära och tertiära strukturer
Chymopapains struktur löstes med röntgendiffraktionstekniker . Analys av denna struktur visade att chymopapain hade 7 alfahelixregioner , 10 beta-arkregioner och 2 loopvarv. Dessa 2 varv är huvudskillnaden mellan chymopapains struktur och andra papayaproteinasproteiner som papain eller caricain , som har liknande konformationer.
Dessutom presenterar chymopapain 3 disulfidbindningar som post-traducionala modifieringar etablerade mellan resterna 156–197, 190–229 och 287–338.
Kvartär struktur
Chymopapain uppvisar en kvartär struktur som kännetecknas av bildandet av homodimerer , vilket innebär att två kymopapainkedjor förenar varandra genom svaga interaktioner för att forma en unik biologisk struktur.
Fungera
Förutom alla andra enzymer i PLCP-gruppen är chymopapain ett cysteinproteas . Proteaser är enzymer som hydrolyserar peptidbindningar mellan resterna som bildar ett protein. Vid varje hydrolys frigörs en vattenmolekyl. Specifikt är ett cysteinproteas ett enzym som bryter peptidbindningen genom att använda tiolgruppen i en cysteinrest som nukleofil. För att hydrolysera måste hela den katalytiska triaden av enzymet användas. Denna utgörs av en cystein , Cys159-resten, en histidin , His203-resten och en tredje rest, som tenderar att vara en asparagin , specifikt Asn313-resten. De funktionella grupperna som används i reaktionen är tiolgruppen i cysteinet och imidazoliumringen i en histidin. Asparaginresten arbetar med att orientera histidinets imidazoliumring.
Mekanismen som följs är exponerad nedan:
- Tiolgruppen från cysteinet förlorar en proton, så den blir negativt laddad och histidinets aminogrupp fångar en proton, vilket ger den en positiv laddning .
- Cysteinet gör en bindning med kolet som bryter kolets dubbelbindning med syre och omvandlar det till en enkel bindning.
- Aminogruppen attraheras av histidinets positiva laddning och en bindning mellan dessa två bildas. Peptidbindningen är nu bruten och karbonylgruppen återskapas.
- NH2R - gruppen frisätts från histidinet. Bindningen mellan tiolgruppen från cysteinet och kolet bryts och en NHR-grupp ersätter den.
När dessa två bindningar bryts är den katalytiska triaden från chymopapain tillgänglig för att användas igen.
Syntes
Chymopapain används inte längre som en standardmetod för att behandla kronisk ländryggssmärta på grund av dess potentiella biverkningar. Därför finns det inget behov av att syntetisera det på konstgjord väg. Faktum är att försäljningen och distributionen av detta protein avbröts i USA 2003.
Trots den enorma mängden framgångsrik användning för att behandla diskbråck, avbröts användningen av chymopapain inte på grund av faror eller brister utan snarare för att det inte längre är tillgängligt på grund av ett beslut av dess enda tillverkare att stoppa produktionen. Wardlaw D. Ischias orsakad av diskbråck: Varför nekas Chymopapain Chemonucleolysis för våra patienter? Int J Spine Surg. 2016 31 dec;10:44. doi: 10.14444/3044. PMID: 28377858; PMCID: PMC5374990.
Flera studier har dock visat på olika framgångsrika metoder för att extrahera och isolera proteaset, som varierar mellan författarna. Den vanligaste proceduren är den som beskrevs av Baines & Brocklehurst 1979.
För att få proteinet används Carica Papaya-frukter, eftersom chymopapain finns i dess latex. Papaya bör vara precis i föregående steg innan mognad, vilket innebär en genomsnittlig diameter på 6–10 cm.
Vissa längsgående snitt på 2 mm djup måste göras genom huden för att fortsätta till extraktion av latex, som kan samlas upp i fast form några minuter efter extraktionen. Proteaserna som finns i fruktens latex är inaktiva prekursorer som aktiveras när papayan är sårad. I 0,3 ml latex finns ca 15 mg chymopapain.
Om vi vill bevara de proteolytiska egenskaperna måste latex konserveras med natriummetabisulfit och förvaras vid en låg temperatur på cirka -10 °C. Om den används omedelbart efter snitten, tillsätts en buffert för att extrahera proteinerna: EDTA , ammoniumsulfat eller fosfatbuffert, alla med en koncentration på 0,5 mM och ett pH på 7.
Det är också viktigt att blockera tiolfunktionerna för att undvika luftoxidation och förlust av proteolytisk aktivitet.
För att eliminera organiska och olösliga molekyler filtreras provet först och centrifugeras därefter vid 11000g i 30 minuter. Pelleten kasseras och supernatanten tillsätts till 96% alkohol med ett förhållande av 1:3. Föroreningar fälls ut och kan elimineras genom filtrering. görs (NH4 ) 2SO4 - fraktionering genom tillsats av denna substans i en koncentration av 0,472 mg/ml . Chymopapain fälls ut och kan hämtas genom en annan centrifugering, återigen vid 11 000 g under 30 minuter. Supernatanten kasseras och jonbyteskromatografin kan utföras med en linjär gradient på 100 mM (Na + ) och olika elueringsvolymer. Att studera A 280 chymopapain finns i fraktionen 750-1000 ml.
När chymopapain väl har isolerats kan det kristalliseras genom gradvis tillsats av natriumklorid vid pH 2,0, vilket kan ta upp till 4 dagar.
Medicinska tillämpningar
| Kliniska data | |
|---|---|
Administreringsvägar _ |
Injektion i intervertebral disk |
| ATC-kod | |
| Rättslig status | |
| Rättslig status |
|
| Identifierare | |
| CAS-nummer | |
| ChemSpider |
|
| UNII | |
| ChEMBL | |
  (vad är detta?)
| |
Chymopapain är ett av subtrakten som används vid kemonukleolys (en typ av perkutan diskektomi) . Denna metod var ett nytt förslag för att behandla primär lumbal intervertebral disksjukdom med en icke-kirurgisk metod. Faktum är att behandlingen består av en injektion av proteolytiska enzymer för att lösa upp den hernierade nucleus pulposus i mellankotdiskarna. Renat chymopapain är huvudkomponenten i injektionen, huvudsakligen sammansatt av 20 mg i fem milliliter. Det tillhandahålls i injektionsflaskor som innehåller 10 000 enheter av det lyofiliserade medlet med 0,37 mg dinatriumedetat, 3,5 mg cysteinhydrokloridmonohydrat och 1,0 mg bisulfid. Alla fungerar som stabilisatorer och aktivatorer. Natriumhydroxid är ansvarig för att justera lösningens pH. Därefter rehydreras injektionen med 5 milliliter sterilt vatten.
En kirurg injicerar lösningen direkt i diskbråcket på ryggraden för att lösa upp en del av den och lindra smärtan. Denna process är under fluoroskopisk kontroll. Chymopapain ansvarar för katalys, både in vivo och in vitro, en snabb minskning av viskositeten och, som en konsekvens, vikten av nucleus pulposus . I själva verket är det en depolymerisering av kondromuchoproteinet och en minskning av förmågan hos en skiva att suga upp vätska. Dosen för en enskild intervertebral disk är 2 till 4 nanokataler, med en maximal dos per patient på 8 nanokataler. Chymopapain-injektioner ges normalt under lokal, snarare än allmän, anestesi .
Detta enzym har studerats av universitetsavdelningar runt om i världen. Det testades lika mycket på djur som på människor och, mycket sällan, orsakade det allvarliga biverkningar inklusive förlamning av benen och död . Det kunde också orsaka anafylaxi , men det sågs bara hos 1 % av patienterna som fick medicinen.
Försäljningen och distributionen av chymopapain avbröts i USA den 27 januari 2003, efter att företaget som tillverkade det beslutat att sluta sälja det över hela världen.
Se även
Vidare läsning
- MEROPS onlinedatabas för peptidaser och deras inhibitorer : C01.002
- Datablad för Papain från BIOZYM
