Romanowsky fläck
.jpg)
Romanowsky-färgning , även känd som Romanowsky-Giemsa-färgning , är en prototypisk färgningsteknik som var föregångaren till flera distinkta men liknande färger som ofta användes inom hematologi (studiet av blod) och cytopatologi (studiet av sjuka celler). Färger av Romanowsky-typ används för att differentiera celler för mikroskopisk undersökning i patologiska prover, särskilt blod- och benmärgsfilmer , och för att upptäcka parasiter som malaria i blodet. Fläckar som är relaterade till eller härrörande från fläckar av Romanowsky-typ inkluderar Giemsa , Jenner , Wright , Field , May–Grünwald och Leishman fläckar. Färgningstekniken är uppkallad efter den ryske läkaren Dmitri Leonidovich Romanowsky (1861–1921), som var en av de första att inse dess potential för användning som blodfläck.
Mekanism
Värdet av Romanowsky-färgning ligger i dess förmåga att producera ett brett spektrum av nyanser, vilket gör att cellulära komponenter lätt kan differentieras. Detta fenomen kallas Romanowsky-effekten , eller mer allmänt som metakromasi .
Romanowsky-effekt
År 1891 utvecklade Romanowsky en färg med en blandning av eosin (typiskt eosin Y ) och åldrade lösningar av metylenblått som bildade nyanser som inte kan tillskrivas enbart färgningskomponenterna: distinkta nyanser av lila i kromatinet i cellkärnan och i granuler i cytoplasman hos några vita blodkroppar. Detta blev känt som Romanowsky- eller Romanowsky-Giemsa-effekten. Eosin och rent metylenblått ensamt (eller i kombination) ger inte Romanowsky-effekten, och de aktiva fläckarna som ger effekten anses nu vara azurblå B och eosin.
Polykrom metylenblått
Färger av Romanowsky-typ kan göras av antingen en kombination av rena färgämnen eller av metylenblått som har utsatts för oxidativ demetylering , vilket resulterar i nedbrytning av metylenblått till flera andra fläckar, av vilka några är nödvändiga för att producera Romanowsky-effekten . Metylenblått som har genomgått denna oxidativa process är känt som "polykrom metylenblått". Polykrom metylenblått kan innehålla upp till 11 färgämnen, inklusive metylenblått , azurblått A , azurblått B, azurblått C, tionin , metylenviolett Bernthesen, metyltionolin och tionolin. Den exakta sammansättningen av polykrom metylenblått beror på vilken metod som används, och även partier av fläcken från samma tillverkare kan variera i sammansättning.
Även om azurblått B och eosin har visat sig vara de komponenter som krävs för att producera Romanowsky-effekten, har dessa fläckar i sina rena former inte alltid använts i formuleringen av färgningslösningarna. De ursprungliga källorna till azurblått B (en av oxidationsprodukterna av metylenblått) var från polykromerade metylenblåttlösningar, som behandlades med oxidationsmedel eller fick åldras naturligt i fallet med Romanowsky. Ernst Malachowsky 1891 var den första som medvetet polykrom metylenblått för användning i en fläck av Romanowsky-typ.
Typer
May-Grünwald-Giemsa
May-Grünwald-Giemsa-färgningen är en tvåstegsprocedur som inkluderar första färgning med May-Grünwald-färgning, som inte ger Romanowsky-effekten, följt av färgning av Giemsa-färgen som ger Romanowsky-effekten.
Wrights och Wright-Giemsa fläckar
Wrights fläck kan användas ensam eller i kombination med Giemsa fläcken, som är känd som Wright-Giemsa fläcken. Wrights fläck är uppkallad efter James Homer Wright som 1902 publicerade en metod som använde värme för att framställa polykrom metylenblått, som kombineras med eosin Y. Det polykromerade metylenblått kombineras med eosin och får fällas ut och bildar ett eosinat som återupplöses i metanol . Tillsatsen av Giemsa till Wrights färg ökar ljusstyrkan hos den "rödlila" färgen på de cytoplasmatiska granulerna. Wright- och Wright-Giemsa-färgerna är två av de fläckar av Romanowsky-typ som är vanliga i USA och används huvudsakligen för färgning av blod- och benmärgsfilmer.
Leishman fläck
År 1901 utvecklade William Leishman en färg som liknade Louis Jenners men med ersättning av ren metylenblått med polykrom metylenblått. Leishmans färg framställs från eosinatet av polykrom metylenblått och eosin Y med användning av metanol som lösningsmedel.
Giemsa fläck
Giemsa-färgen är sammansatt av "Azure II" och eosin Y med metanol och glycerol som lösningsmedel. "Azure II" tros vara en blandning av azurblå B (som Giemsa kallade "azurblå I") och metylenblått, även om den exakta sammansättningen av "azurblå I" anses vara en affärshemlighet. Jämförbara formuleringar som använder kända färgämnen har publicerats och är kommersiellt tillgängliga. Giemsa-färgning anses vara standardfärgen för upptäckt och identifiering av malariaparasiten.
Kliniska betydelser
Blod- och benmärgspatologi
Färger av Romanowsky-typ används i stor utsträckning vid undersökning av blod, i form av blodfilmer , och vid mikroskopisk undersökning av benmärgsbiopsier och aspiratutstryk . Undersökning av både blod och benmärg kan vara av betydelse vid diagnos av en mängd olika blodsjukdomar. I USA används Wright- och Wright-Giemsa-varianterna av fläckar av Romanowsky-typ i stor utsträckning, medan Giemsa-färger är vanliga i Europa.
Detektering av malaria och andra parasiter
Av fläckarna av Romanowsky-typ är Giemsa-färgen särskilt viktig vid upptäckt och identifiering av malariaparasiter i blodprover . Tester för upptäckt av malariaantigen är ett alternativ till färgning och mikroskopisk undersökning av blodfilmer för att upptäcka malaria.
Används inom cytopatologi
Färger av Romanowsky-typ används också för färgning av cytopatologiska prover, såsom de som produceras av finnålsaspirater och cerebrospinalvätska från lumbalpunkteringar .
Historia
.jpg)
Även om det råder debatt om vem som förtjänar beröm för denna allmänna färgningsmetod, har populär användning tillskrivit den Dmitri Leonidovich Romanowsky.
På 1870-talet använde Paul Ehrlich en blandning av sura och basiska färgämnen inklusive surt fuchsin (syrafärgämne) och metylenblått (basfärgämne) för att undersöka blodfilmer. År 1888 använde Cheslav Ivanovich Chenzinsky metylenblått, men ersatte det sura fuchsin som användes av Ehrlich med eosin. Chenzinskys färgkombination kunde färga malariaparasiten (en medlem av släktet Plasmodium ). Varken Ehrlichs eller Chenzinskys fläckar producerade Romanowsky-effekten eftersom metylenblått de använde inte var polykrom.
Dmitri Romanowsky publicerade 1890 preliminära fynd av sin blodfläck (en kombination av åldrat metylenblått och eosin), inklusive resultaten när den applicerades på malariainfekterat blod. Denna användning av polykrom metylenblått särskiljde Romanowskys färg (och de efterföljande formuleringarna) från de av Ehrlich och Chenzinsky, som saknade den lila nyans som förknippas med Romanowsky-effekten. Romanowskys publikation från 1890 innehöll inte en beskrivning av hur han modifierade sin metylenblå lösning, men i sin doktorsavhandling från 1891 beskrev han metylenblått bäst som det användes efter att mögel började bildas på ytan. Förutom användningen av en åldrad metylenblå lösning, var Romanowskys färg baserad på Chenzinskys färgningsteknik. Romanowskys användning av sin metod för att studera malariaparasiten har tillskrivits det fortsatta intresset för hans färgningsmetod.
Ernst Malachowsky har krediterats för att självständigt observera samma färgkombination som Dmitri Romanowsky 1891, även om han också har krediterats för att vara den första att göra det. Malachowsky var den första som använde en avsiktligt polykrom metylenblå lösning, vilket Malachowsky åstadkom genom att tillsätta borax till färgningsblandningen. Malachowsky rapporteras ha demonstrerat fläcken den 15 juni 1890 och samma år publicerat en tidning som "beskriver hans offentliga demonstration". Både Romanowsky- och Malachowsky-metoderna kunde färga malariaparasitens kärna och cytoplasma , när de använda fläckarna fram till denna punkt endast hade färgat cytoplasman.
1899 utvecklade Louis Leopold Jenner en mer stabil version av metylenblått och eosinfärgen genom att samla upp fällningen som bildas i vattenbaserade blandningar och återupplösa den i metanol . Romanowsky-typ fläckar framställda från de insamlade fällningarna är ibland kända som eosinater . Förutom att öka stabiliteten hos fläcken, hade användningen av metanol i Jenners fläck effekten att blodproverna fixerades , även om Jenners version av fläcken inte ger Romanowsky-effekten.
Richard May och Ludwig Grünwald publicerade 1892 en version av fläcken (nu känd som May–Grünwald-fläcken ) som liknar den version som Jenner föreslog 1899, och som inte heller producerar Romanowsky-effekten.
År 1901 utvecklade både Karl Reuter och William Leishman fläckar som kombinerade Louis Jenners användning av alkohol som lösningsmedel och Malachowskys användning av polykrom metylenblått. Reuters fläck skiljde sig från Jenners genom att använda etylalkohol istället för metanol, och Leishmans skiljde sig från Jenners genom att använda eosin B istället för eosin Y .
James Homer Wright publicerade 1902 en metod som använder värme för att polykroma metylenblått, som han kombinerade med eosin Y. Denna teknik är känd som Wrights färg .
Gustav Giemsas namn har också blivit förknippat med fläcken eftersom han är krediterad för att ha publicerat en användbar formulering och ett protokoll 1902. Giemsa försökte använda kombinationer av rena färgämnen snarare än polykromerade metylenblåttlösningar som är mycket varierande i sammansättning. Giemsa sålde rättigheterna att producera sin färg, men publicerade aldrig fullständigt detaljer om hur han producerade den, även om man tror att han använde en kombination av azurblått B och metylenblått. Giemsa publicerade ett antal modifieringar av sina fläckar mellan 1902 och 1934. 1904 föreslog han att man skulle lägga till glycerin till sin fläck tillsammans med metanolen för att öka dess stabilitet.
Giemsa-färgpulver som producerats i Tyskland användes i stor utsträckning i USA tills leveransen avbröts under första världskriget , vilket orsakade ökat utnyttjande av James Homer Wrights metod för polykromering av metylenblått.