Proteinmetoder

För metoder med DNA eller RNA, se Nukleinsyrametoder .

Proteinmetoder är de tekniker som används för att studera proteiner . Det finns experimentella metoder för att studera proteiner (t.ex. för att detektera proteiner, för att isolera och rena proteiner och för att karakterisera proteiners struktur och funktion, vilket ofta kräver att proteinet först renas). Beräkningsmetoder använder vanligtvis datorprogram för att analysera proteiner. Men många experimentella metoder (t.ex. masspektrometri ) kräver beräkningsanalys av rådata.

Genetiska metoder

Experimentell analys av proteiner kräver typiskt uttryck och rening av proteiner. Expression uppnås genom att manipulera DNA som kodar för proteinet/proteinerna av intresse. Därför kräver proteinanalys vanligtvis DNA-metoder, särskilt kloning . Några exempel på genetiska metoder inkluderar konceptuell translation, platsstyrd mutagenes , användning av ett fusionsprotein och matchning av allel med sjukdomstillstånd. Vissa proteiner har aldrig sekvenserats direkt, men genom att översätta kodon från kända mRNA-sekvenser till aminosyror med en metod som kallas konceptuell translation. (Se genetisk kod .) Platsstyrd mutagenes introducerar selektivt mutationer som ändrar strukturen hos ett protein. Funktionen av delar av proteiner kan bättre förstås genom att studera förändringen i fenotyp som ett resultat av denna förändring. Fusionsproteiner tillverkas genom att infoga proteintaggar, såsom His-taggen , för att producera ett modifierat protein som är lättare att spåra. Ett exempel på detta skulle vara GFP-Snf2H som består av ett protein bundet till ett grönt fluorescerande protein för att bilda ett hybridprotein. Genom att analysera DNA alleler identifieras som associerade med sjukdomstillstånd, såsom vid beräkning av LOD-poäng .

Proteinextraktion från vävnader

Proteinextraktion från vävnader med tuffa extracellulära matriser (t.ex. biopsiprover, venös vävnad, brosk, hud) uppnås ofta i laboratoriemiljö genom slagpulverisering i flytande kväve. Prover fryses i flytande kväve och utsätts därefter för slag eller mekanisk malning. Eftersom vattnet i proverna blir mycket sprött vid dessa temperaturer reduceras proverna ofta till en samling av fina fragment, som sedan kan lösas upp för proteinextraktion. Rostfria stålanordningar kända som vävnadspulveriserare används ibland för detta ändamål.

Fördelarna med dessa anordningar inkluderar höga nivåer av proteinextraktion från små, värdefulla prover, nackdelar inkluderar korsningskontamination på låg nivå.

Proteinrening

• Proteinisolering
  • Kromatografimetoder: jonbyte , storleksuteslutningskromatografi (eller gelfiltrering) , affinitetskromatografi
• Proteinextraktion och solubilisering
• Koncentrera proteinlösningar
• Gelelektrofores
  • Gelelektrofores under denaturerande förhållanden
  • Gelelektrofores under icke-denaturerande förhållanden
  • 2D gelelektrofores
• Elektrofokusering

Upptäcka proteiner

Den avsevärt lilla storleken på proteinmakromolekyler gör identifiering och kvantifiering av okända proteinprover särskilt svårt. Flera pålitliga metoder för att kvantifiera protein har utvecklats för att förenkla processen. Dessa metoder inkluderar Warburg-Christian-metoden , Lowry-analysen och Bradford-analysen (som alla är beroende av absorbansegenskaper hos makromolekyler).

Bradford-analysmetoden använder ett färgämne för att binda till protein. Det vanligaste är att Coomassie brilliant blue G-250 färgämne används. När det är fritt från protein är färgämnet rött men när det väl är bundet till protein blir det blått. Färgämnesproteinkomplexet absorberar ljus maximalt vid våglängden 595 nanometer och är känsligt för prover som innehåller allt från 1 ug till 60 ug. Till skillnad från Lowry och Warburg-Christian metoder, förlitar sig Bradford-analyser inte på innehållet av tryptofan och tyrosin i proteiner, vilket gör att metoden kan vara mer exakt hypotetiskt.

Lowry-analysen liknar biuretanalyser, men den använder Folin-reagens som är mer exakt för kvantifiering. Folinreagens är stabilt endast vid sura förhållanden och metoden är känslig för snedvridning av resultat beroende på hur mycket tryptofan och tyrosin som finns i det undersökta proteinet. Folinreagenset binder till tryptofan och tyrosin vilket innebär att koncentrationen av de två aminosyrorna påverkar metodens känslighet. Metoden är känslig vid koncentrationsintervall som liknar Bradford-metoden, men kräver en minimal mängd mer protein.

Warburg–Christian-metoden screenar proteiner vid deras naturligt förekommande absorbansintervall. De flesta proteiner absorberar ljus mycket bra vid 280 nanometer på grund av närvaron av tryptofan och tyrosin, men metoden är mottaglig för varierande mängder av aminosyrorna den är beroende av.

Fler metoder listas nedan som länkar till mer detaljerade redovisningar för deras respektive metoder.

Icke-specifika metoder som endast detekterar totalt protein

• Absorbans : Avläst vid 280 eller 215 nm. Kan vara väldigt felaktigt. Detektion inom intervallet 100 μg/mL till 1 mg/ml. Förhållandet av absorbansavläsningar tagna vid 260/280 kan indikera renhet/kontamination av provet (rena prover har ett förhållande <0,8)
• Bradford-proteinanalys : Detektion inom intervallet ~1 mg/ml
• Biuret-testhärledda analyser :
  • Bicinchoninsyraanalys (BCA-analys) : Detektion ner till 0,5 μg/ml
  • Lowry Protein-analys : Detektion inom intervallet 0,01–1,0 mg/ml
• Fluoreskamin : Kvantifierar proteiner och peptider i lösning om primär amin finns i aminosyrorna
• Amido svart : Detektion inom intervallet 1-12 μg/ml
• Kolloidalt guld : Detektion i intervallet 20 - 640 ng/ml
• Detektering av kväve :
  • Kjeldahl-metoden : används främst för livsmedel och kräver oxidation av material
  • Dumas metod : används främst för mat och kräver förbränning av material

Specifika metoder som kan detektera mängden av ett enda protein

• Spektrometrimetoder :
  • Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) : Kromatografimetod för att detektera proteiner eller peptider
  • Vätskekromatografi – masspektrometri (LC/MS) : Kan detektera proteiner i låga koncentrationer (ng/ml till pg/ml) i blod och kroppsvätskor, till exempel för farmakokinetik .
• Antikroppsberoende metoder:
  • Enzymkopplad immunosorbentanalys ( ELISA ): Kan specifikt detektera protein ner till pg/ml.
  • Proteinimmunutfällning : teknik för att fälla ut ett proteinantigen ur lösningen med hjälp av en antikropp som specifikt binder till det specifika proteinet.
  • Immunelektrofores : separation och karakterisering av proteiner baserad på elektrofores och reaktion med antikroppar.
  • Western blot : kopplar gelelektrofores och inkubation med antikroppar för att detektera specifika proteiner i ett prov av vävnadshomogenat eller extrakt (en typ av immunelektroforesteknik ).
  • Proteinimmunfärgning

Proteinstrukturer

• Röntgenkristallografi
• Protein NMR
• Kryo-elektronmikroskopi
• Röntgenspridning med liten vinkel
• Cirkulär dikroism

Interaktioner som involverar proteiner

• Proteinfotavtryck

Interaktioner mellan protein och protein

• (Jäst) två-hybridsystem
• Proteinfragmentkomplementeringsanalys
• Samimmunutfällning
• Affinitetsrening och masspektrometri
• Närhetsligeringsanalys
• Närhetsmärkning

Protein–DNA-interaktioner

• Chip-på-chip
• Chip-sekvensering
• DamID
• Termofores i mikroskala

Protein–RNA-interaktioner

• Tåtrycksanalys
• TCP-seq

Beräkningsmetoder

• Molekylär dynamik
• Förutsägelse av proteinstruktur
• Proteinsekvensanpassning (sekvensjämförelse, inklusive BLAST )
• Protein strukturell anpassning
• Proteinontologi (se genontologi )

Andra metoder

• Väte-deuterium utbyte
• Masspektrometri
• Proteinsekvensering
• Proteinsyntes
• Proteomics
• Peptidmass-fingeravtryck
• Ligandbindningsanalys
• Östra blotting
• Metabolisk märkning
  • Tung isotopmärkning
  • Radioaktiv isotopmärkning

Se även

• CSH-protokoll
• Aktuella protokoll

Bibliografi

•   Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki och Stuart J. Edelstein. (1996.) Protein Methods , 2 uppl., Wiley Publishers. ISBN 0-471-11837-0 .