Proteinfotavtryck
Proteinfootprinting är en term som används för att hänvisa till en metod för biokemisk analys som undersöker proteinstruktur , sammansättning och interaktioner inom en större makromolekylär sammansättning . Det myntades ursprungligen med hänvisning till användningen av begränsad proteolys för att undersöka kontaktställen inom en monoklonal antikropp - proteinantigenkomplex och ett år senare för att undersöka skyddet från hydroxylradikalklyvning som ges av ett protein bundet till DNA i ett DNA-proteinkomplex. I DNA-footprinting föreställs proteinet att göra ett avtryck (eller footprint ) vid en viss interaktionspunkt. Denna sistnämnda metod anpassades genom direkt behandling av proteiner och deras komplex med hydroxylradikaler och kan generellt betecknas RP-MS (för Radical Probe - Mass Spectrometry) besläktad med beteckningen som används för väte-deuteriumutbytesmasspektrometri (betecknad HD-MS) eller HX-MS).
Hydroxylradikalproteinfotavtryck
Tidsupplöst hydroxylradical protein footprinting (HRPF) som använder masspektrometrianalys skapades och utvecklades i slutet av 1990-talet i synkrotronradiolysstudier . Samma år rapporterade dessa författare (Maleknia et al.) om användningen av en elektrisk urladdningskälla för att åstadkomma oxidation av proteiner på millisekunders tidsskalor när proteiner passerar från den elektrosprayade lösningen till masspektrometern. År senare, 2005, introducerade forskarna Hambly och Gross en metod för proteinoxidation på mikrosekunders tidsskala med hjälp av laserblixtfotolys av väteperoxid för att generera hydroxylradikaler. Denna metod, snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP), gjorde anspråk på att fotavtrycka proteiner snabbare än de ändrar sin veckning även om denna tidsram har utmanats med tanke på väteperoxid, som inte fanns i de ursprungliga studierna, och sekundära radikaler, reagerar ensamma in situ under tiotals millisekunder. Dessa tillvägagångssätt har sedan använts för att bestämma proteinstrukturer, proteinveckning, proteindynamik och protein-proteininteraktioner.
Till skillnad från nukleinsyror oxiderar proteiner snarare än spjälkar på dessa tidsskalor. Analys av produkterna genom masspektrometri visar att proteiner oxideras på ett begränsat sätt (ungefär 10–30 % av det totala proteinet) vid ett antal aminosyrasidokedjor över proteinerna. Oxidationshastigheten eller -nivån vid de reaktiva aminosyrasidokedjorna (Met, Cys, Trp, Tyr, Phe, His, Pro och Leu) ger ett mått på deras tillgänglighet till bulklösningsmedlet. Mekanismerna för sidokedjeoxidation undersöktes genom att utföra radiolysreaktionerna i 18 O-märkt vatten .
Producerar OH-radikaler
En kritisk egenskap hos dessa experiment är behovet av att exponera proteiner för hydroxylradikaler under begränsade tidsskalor i storleksordningen 1-50 ms, vilket inducerar 10-30% oxidation av totalt protein. Ett ytterligare krav är att generera hydroxylradikaler från bulklösningsmedlet (dvs vatten) (ekvationerna 1 och 2), inte väteperoxid som kan finnas kvar för att oxidera proteiner även utan andra stimuli.
- H 2 O → H 2 O +• + e − + H 2 O *
- H 2 O +• + H 2 O → H 3 O + + OH •
Hydroxylradikaler kan produceras i lösning genom en elektrisk urladdning inom en konventionell elektrosprayjoniseringskälla (ESI) med atmosfäriskt tryck. När en hög spänningsskillnad (~8 keV) hålls mellan en elektrospraynål och en provtagningsöppning till massanalysatorn, kan radikaler produceras i lösning vid elektrospraynålsspetsen. Denna metod var den första som användes för att tillämpa proteinfotavtryck för att studera ett proteinkomplex.
Metod
Exponeringen av proteiner för en "vit" röntgenstråle av synkrotronljus eller en elektrisk urladdning under tiotals millisekunder ger tillräcklig oxidativ modifiering av ytaminosyrasidokedjorna utan skada på proteinstrukturen. Dessa produkter kan lätt detekteras och kvantifieras med masspektrometri. Genom att justera tiden för radiolys eller vilka proteinjoner som tillbringar i utsläppskällan, är ett tidsupplöst tillvägagångssätt möjligt som är värdefullt för studiet av proteindynamik.
Analys
Ett datorprogram (PROXIMO) har också skrivits för att hjälpa till att modellera proteinkomplex med hjälp av data från RP-MS/Protein footprinting-metoden. RP-MS/Protein footprinting studier av proteinkomplex kan också använda beräkningsmetoder för att hjälpa till med denna modellering.
Ansökningar
Tillämpningen av jonmobilitetsmasspektrometri har definitivt visat att de betingelser som används i RP-MS/Protein footprinting experiment inte förändrar strukturen hos proteiner.
Andra studier har utvidgat metoden för att studera tidig debut av proteinskador med tanke på metodens radikala grund och betydelsen av syrebaserade radikaler i patogenesen av många sjukdomar inklusive neurologiska störningar och till och med blindhet.