Östlig blot
Eastern blot , eller eastern blotting , är en biokemisk teknik som används för att analysera proteinposttranslationella modifieringar inklusive tillsats av lipider, fosfater och glykokonjugat. Det används oftast för att upptäcka kolhydratepitoper . Sålunda kan eastern blot betraktas som en förlängning av den biokemiska tekniken för western blöt . Flera tekniker har beskrivits med termen "eastern blot(ting)", de flesta använder fosfoprotein blottat från natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) gel på ett polyvinylidenfluorid- eller nitrocellulosamembran . Överförda proteiner analyseras för posttranslationella modifieringar med användning av prober som kan detektera lipider , kolhydrater , fosforylering eller någon annan proteinmodifiering. Eastern blotting bör användas för att hänvisa till metoder som detekterar deras mål genom specifik interaktion mellan de post-translationella modifieringarna och sonden, vilket skiljer dem från en standard far-western blöt . I princip liknar eastern blotting lektinblotting (dvs detektion av kolhydratepitoper på proteiner eller lipider).
Historia och flera definitioner
Definitionen av termen eastern blot är något förvirrad på grund av att flera uppsättningar av författare dubbar en ny metod som eastern blot , eller en derivata därav. Alla definitionerna är ett derivat av tekniken för western blot som utvecklades av Towbin 1979. De nuvarande definitionerna sammanfattas nedan i ordning efter den första användningen av namnet; alla är dock baserade på några tidigare verk. I vissa fall hade tekniken varit i praktiken en tid innan termens införande.
- (1982) Termen eastern blotting avvisades specifikt av två separata grupper: Reinhart och Malamud hänvisade till en proteinblot av en nativ gel som en nativ blöt ; Peferoen et al., valde att hänvisa till deras metod för att dra natriumdodecylsulfat-gel-separerade proteiner på nitrocellulosa med användning av ett vakuum som Vacuum blotting .
- (1984) Mellanösternblotting har beskrivits som en blöt av polyA-RNA (upplöst av agaros) som sedan immobiliseras. Det immobiliserade RNA:t undersöks sedan med användning av DNA.
- (1996) Eastern-western blot användes först av Bogdanov et al. Metoden involverade blotting av fosfolipider på polyvinylidenfluoride eller nitrocellulosamembran före överföring av proteiner till samma nitrocellulosamembran genom konventionell western blotting och sondering med konformationsspecifika antikroppar. Denna metod är baserad på tidigare arbete av Taki et al. 1994, som de ursprungligen kallade TLC blotting , och var baserad på en liknande metod som introducerades av Towbin 1984.
- (2000) Fjärranöstern blotting verkar ha namngivits första gången 2000 av Ishikawa & Taki. Metoden beskrivs mer utförligt i artikeln om far-eastern blot , men är baserad på antikropps- eller lektinfärgning av lipider som överförs till polyvinylidenfluoridmembran.
- (2001) Eastern blotting beskrevs som en teknik för att detektera glykokonjugat genererade genom blotting av BSA på polyvinylidenfluoridmembran, följt av perjodatbehandling. Det oxiderade proteinet behandlas sedan med en komplex blandning, vilket genererar ett nytt konjugat på membranet. Membranet undersöks sedan med antikroppar för epitoper av intresse. Denna metod har också diskuterats i senare arbeten av samma grupp. Metoden är i huvudsak far-eastern blot.
- (2002) Eastern blot har också använts för att beskriva en immunoblot utförd på proteiner blottade på ett polyvinylidenfluoridmembran från en PAGE-gelkörning med motsatt polaritet. Eftersom detta i huvudsak är en western blot , användes laddningsomkastningen för att dubba denna metod till en eastern blot .
- (2005) Eastern blot har använts för att beskriva en blöt av proteiner på polyvinylidenfluoridmembran där sonden är en aptamer snarare än en antikropp. Detta kan ses som liknar en Southern blot , men interaktionen är mellan en DNA-molekyl (aptameren) och ett protein, snarare än två DNA-molekyler. Metoden liknar southwestern blot .
- (2006) Eastern blotting har använts för att hänvisa till detektion av fusionsproteiner genom komplementering. Namnet är baserat på användningen av en enzymaktivator (EA) som en del av upptäckten.
- (2009) Eastern blotting har senast omdöpts av Thomas et al. som en teknik som sonderar proteiner blottade på polyvinylidenfluoridmembran med lektiner, koleratoxin och kemiska färger för att detektera glykosylerade, lipoylerade eller fosforylerade proteiner. Dessa författare skiljer metoden från den avlägsna östern blot som namnges av Taki et al. genom att de använder lektinsonder och andra färgningsreagens.
- (2009) Eastern blot har använts för att beskriva en blöt av proteiner på nitrocellulosamembran där sonden är en aptamer snarare än en antikropp. Metoden liknar southwestern blot.
- (2011) En nyligen genomförd studie använde termen eastern blotting för att beskriva detektion av glykoproteiner med lektiner som concanavalin A
Det finns uppenbarligen ingen enskild accepterad definition av begreppet. En höjdpunktsartikel nyligen har intervjuat Ed Southern , upphovsman till Southern blot , angående en omdopning av eastern blotting från Tanaka et al. Artikeln liknar den östliga blotten med "älvor, enhörningar och en gratis lunch" och säger att östernblotten "inte existerar". Eastern blot nämns i en immunologilärobok som jämför de vanliga blottingmetoderna (södra, nordliga och västra), och anger att "östernblotten finns dock bara i testfrågor."
Principerna som används för eastern blotting för att detektera glykaner kan spåras tillbaka till användningen av lektiner för att detektera proteinglykosylering . Det tidigaste exemplet för detta detektionssätt är Tanner och Anstee 1976, där lektiner användes för att detektera glykosylerade proteiner isolerade från mänskliga erytrocyter . Den specifika detekteringen av glykosylering genom blotting kallas vanligtvis lektinblotting . En sammanfattning av nyare förbättringar av protokollet har tillhandahållits av H. Freeze.
Ansökningar
En tillämpning av tekniken inkluderar detektion av proteinmodifieringar i två bakteriearter Ehrlichia - E. muris och IOE. Koleratoxin B-underenhet (som binder till gangliosider ), concanavalin A (som detekterar mannosinnehållande glykaner) och nitrofosfomolybdat-metylgrönt (som detekterar fosfoproteiner) användes för att detektera proteinmodifieringar. Tekniken visade att de antigena proteinerna från den icke-virulenta E.muris är mer post-translationellt modifierad än den mycket virulenta IOE.
Betydelse
De flesta proteiner som översätts från mRNA genomgår modifieringar innan de blir funktionella i celler. Dessa modifieringar kallas gemensamt för post-translationella modifieringar . De begynnande eller veckade proteinerna, som är stabila under fysiologiska förhållanden, utsätts sedan för ett batteri av specifika enzymkatalyserade modifieringar på sidokedjorna eller ryggraden.
Post-translationell modifiering av proteiner kan inkludera acetylering , acylering ( myristoylering , palmitoylering ), alkylering , arginylering , ADP-ribosylering , biotinylering , formylering , geranylgeranylering , glutamylering, glykosylering , glycylering, lioprenylering, glycylering , lioprenylering , alkylering , alkylering , fosfonanteteinylering , fosforylering , prenylering , selenering , S-nitrosylering , succinylering , sulfatering , transglutamination , sulfinylering, sulfonylering och ubiquitinering (sumoylering, neddylering).
Posttranslationella modifieringar som inträffar vid N-terminalen av aminosyrakedjan spelar en viktig roll vid translokation över biologiska membran. Dessa inkluderar sekretoriska proteiner i prokaryoter och eukaryoter och även proteiner som är avsedda att inkorporeras i olika cell- och organellmembran såsom lysosomer , kloroplast , mitokondrier och plasmamembran . Expression av posttranslaterade proteiner är viktigt vid flera sjukdomar.