Väte-deuterium utbyte
Väte-deuterium-utbyte (även kallat H-D eller H/D-utbyte) är en kemisk reaktion där en kovalent bunden väteatom ersätts med en deuteriumatom , eller vice versa. Den kan lättast appliceras på utbytbara protoner och deuteroner, där en sådan omvandling sker i närvaro av en lämplig deuteriumkälla, utan någon katalysator. Användningen av syra-, bas- eller metallkatalysatorer, i kombination med betingelser med ökad temperatur och tryck, kan underlätta utbytet av icke-utbytbara väteatomer, så länge som substratet är robust för de betingelser och reagens som används. Detta resulterar ofta i perdeuteration: väte-deuterium-utbyte av alla icke-utbytbara väteatomer i en molekyl.
Ett exempel på utbytbara protoner som vanligtvis undersöks på detta sätt är protonerna i amiderna i ett proteins ryggrad . Metoden ger information om lösningsmedelstillgängligheten för olika delar av molekylen och därmed proteinets tertiära struktur . Det teoretiska ramverket för att förstå väteutbyte i proteiner beskrevs först av Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang och han var den första att tillämpa H/D-utbyte för att studera proteiner.
Utbytesreaktion
I protisk lösning utbytbara protoner som de i hydroxyl- eller amingrupper byt ut protoner med lösningsmedlet . Om D2O är lösningsmedel, kommer deuteroner att inkorporeras i dessa positioner. Utbytesreaktionen kan följas med en mängd olika metoder (se Detektion). Eftersom detta utbyte är en jämviktsreaktion bör den molära mängden deuterium vara hög jämfört med de utbytbara protonerna i substratet. Till exempel tillsätts deuterium till ett protein i H 2 O genom att späda H 2 O-lösningen med D 2 O (t.ex. tio gånger). Vanligtvis utförs utbyte vid fysiologiskt pH (7,0–8,0) där proteiner är i sin mest naturliga ensemble av konformationstillstånd.
H/D-utbytesreaktionen kan också katalyseras av syra-, bas- eller metallkatalysatorer såsom platina. För väteatomer av ryggradsamid i proteiner sker den lägsta utbyteshastigheten vid ungefär pH 2,6 i genomsnitt. Genom att utföra utbytet vid neutralt pH och sedan snabbt ändra pH, kan utbyteshastigheterna för amidvätena i ryggraden dramatiskt bromsas eller släckas . pH vid vilket reaktionen släcks beror på analysmetoden. För detektering med NMR kan pH-värdet flyttas till cirka 4,0–4,5. För detektion med masspektrometri sänks pH till minimum av utbyteskurvan, pH 2,6. I det mest grundläggande experimentet får reaktionen pågå under en bestämd tid innan den släcks.
Deuterationsmönstret för en molekyl som har genomgått H/D-utbyte kan bibehållas i aprotiska miljöer. Vissa metoder för deuterationsanalys för molekyler såsom proteiner utförs dock i vattenlösning, vilket innebär att utbytet kommer att fortsätta i långsam takt även efter att reaktionen har släckts. Oönskat deuterium-väte-utbyte benämns back-exchange och olika metoder har utarbetats för att korrigera för detta.
Upptäckt
H–D-utbytet mättes ursprungligen av väteutbytet Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang med hjälp av densitetsgradientrör. I modern tid har H–D-utbytet i första hand övervakats med metoderna: NMR-spektroskopi , masspektrometri och neutronkristallografi . Var och en av dessa metoder har sina fördelar och nackdelar.
NMR-spektroskopi
Väte- och deuteriumkärnor är helt olika i sina magnetiska egenskaper . Således är det möjligt att skilja mellan dem med NMR-spektroskopi . Deuteroner kommer inte att observeras i ett 1H NMR-spektrum och omvänt kommer protoner inte att observeras i ett 2H NMR-spektrum. När små signaler observeras i ett ' H NMR-spektrum av ett starkt deutererat prov, hänvisas dessa till som restsignaler. De kan användas för att beräkna nivån av deuteration i en molekyl. Analoga signaler observeras inte i ^ H NMR-spektra på grund av den låga känsligheten hos denna teknik jämfört med ^ H-analysen. Deuteroner uppvisar vanligtvis mycket liknande kemiska förändringar som deras analoga protoner. Analys via 13C NMR-spektroskopi är också möjlig: de olika spinnvärdena för väte ( 1 / 2 ) och deuterium (1) ger upphov till olika splittringsmultiplikheter. NMR-spektroskopi kan användas för att bestämma platsspecifik deuteration av molekyler.
En annan metod använder HSQC-spektra. Vanligtvis registreras HSQC- spektra vid en serie tidpunkter medan vätet byter ut med deuterium. Eftersom HSQC-experimentet är specifikt för väte, kommer signalen att sjunka exponentiellt när väte byter. Det är då möjligt att anpassa en exponentiell funktion till datan och erhålla utbyteskonstanten. Denna metod ger restspecifik information för alla rester i proteinet samtidigt. Den stora nackdelen är att den kräver en förhandstilldelning av spektrumet för proteinet i fråga. Detta kan vara mycket arbetsintensivt och vanligtvis begränsar metoden till proteiner mindre än 25 kDa . Eftersom det tar minuter till timmar att registrera ett HSQC-spektrum, måste amider som utbyter snabbt mätas med andra pulssekvenser.
Masspektrometri
Väte-deuterium-utbytesmasspektrometri kan bestämma det totala deuteriuminnehållet i molekyler som har genomgått H/D-utbyte. På grund av provberedningen som krävs anses det vanligtvis tillhandahålla en noggrann mätning av endast icke-utbytbara väteatomer. Det kan också involvera H/D-utbyte i gasfasen eller lösningsfasutbyte före jonisering. Det har flera fördelar inom NMR-spektroskopi med avseende på analys av H–D-utbytesreaktioner: mycket mindre material behövs, koncentrationen av provet kan vara mycket låg (så låg som 0,1 uM), storleksgränsen är mycket större och data kan vanligtvis samlas in och tolkas mycket snabbare.
Deuteriumkärnan är dubbelt så tung som vätekärnan eftersom den innehåller en neutron såväl som en proton. Således kommer en molekyl som innehåller en del deuterium att vara tyngre än en som innehåller allt väte. När ett protein deutereras alltmer ökar molekylmassan i motsvarande grad. Att upptäcka förändringen i massan av ett protein vid deuteration möjliggjordes av modern proteinmasspektrometri, som först rapporterades 1991 av Katta och Chait.
Att bestämma platsspecifik deuteration via masspektrometri är mer komplicerat än att använda NMR-spektroskopi. Till exempel kan platsen och den relativa mängden deuteriumutbyte längs peptidryggraden bestämmas grovt genom att utsätta proteinet för proteolys efter att utbytesreaktionen har släckts. Individuella peptider analyseras sedan för total deuteration av varje peptidfragment. Med denna teknik bestäms upplösningen av deuteriumutbytet av storleken på de peptider som produceras under matsmältningen. Pepsin , ett surt proteas , används vanligtvis för proteolys, eftersom släcknings-pH måste bibehållas under den proteolytiska reaktionen. För att minimera back-utbytet måste proteolys och efterföljande masspektrometrianalys göras så snabbt som möjligt. HPLC- separation av den peptiska smältningen utförs ofta vid låg temperatur strax före elektrospraymasspektrometri för att minimera återutbyte. På senare tid UPLC använts på grund av dess överlägsna separationsförmåga.
Det föreslogs 1999 att det skulle kunna vara möjligt att uppnå singelrestupplösning genom att använda kollisionsinducerad dissociation (CID) fragmentering av deutererade peptider i samband med tandemmasspektrometri . Det upptäcktes snart att CID orsakar "kryptering" av deuteriumpositionen i peptiderna. Fragmentering producerad av MALDI in-source decay (ISD), elektroninfångningsdissociation (ECD) och elektronöverföringsdissociation (ETD) fortsätter dock med liten eller ingen förvrängning under de korrekta experimentella förhållandena. Förvrängning av isotopmärkningen orsakas av kollisionsupphettning före dissociation av jonen och medan CID orsakar förvrängning, kan kollisionsupphettning också inträffa under jonisering och jontransport. Genom noggrann optimering av instrumentparametrar som orsakar jonuppvärmning kan emellertid vätekryptering minimeras till en grad som bevarar lösningsfasens isotopmärkning tills fragmentering kan utföras med användning av en teknik där kryptering inte inträffar. På senare tid har ultraviolett fotodissociation (UVPD) också undersökts som en möjlig fragmenteringsteknik för att lokalisera deuterium i peptider och proteiner. I detta avseende har slutsatserna blandats, medan det är möjligt att erhålla UVPD-fragment som inte har genomgått kryptering under vissa förhållanden, andra har visat att kryptering kan ske för både peptider och proteiner under själva UVPD-fragmenteringssteget. Teorin som konsoliderar dessa uppenbara motsägelser har att göra med den dubbla fragmenteringsvägen som kan uppstå från UV-bestrålning av peptider och proteiner, dvs direkt och statistisk dissociation. Det vill säga, om experimentella förhållanden gynnar direkt dissociation och prekursorjonen hålls vid låga interna energier före och under fragmentering kommer deuteriumnivån hos de resulterande fragmenten att motsvara den icke-krypterade prekursorn. Emellertid kan experimentella förhållanden gynna statistisk dissociation under UV-bestrålning, särskilt vid långa bestrålningstider och lågt gastryck, vilket leder till intern omvandling av den elektroniska excitationsenergin som UV-fotonerna bidrar med. Resultatet är vibrationsexcitation av den bestrålade molekylen som i sin tur genomgår förvrängning.
Neutronkristallografi
Väte-deuterium-utbyte av snabbt utbytande arter (t.ex. hydroxylgrupper) kan mätas vid atomupplösning kvantitativt genom neutronkristallografi och i realtid om utbyte utförs under diffraktionsexperimentet.
Högintensiva neutronstrålar genereras i allmänhet av spallation vid linac partikelacceleratorer såsom spallationsneutronkällan . Neutroner diffrakterar kristaller på samma sätt som röntgenstrålar och kan användas för strukturell bestämning. Väteatomer, med mellan en och noll elektroner i en biologisk miljö, diffrakterar röntgenstrålar dåligt och är i praktiken osynliga under normala experimentella förhållanden. Neutroner sprids från atomkärnor och kan därför detektera väte- och deuteriumatomer.
Väteatomer ersätts rutinmässigt med deuterium, vilket introducerar en stark och positiv spridningsfaktor. Det är ofta tillräckligt att endast ersätta lösningsmedlet och de labila väteatomerna i en proteinkristall genom ångdiffusion. I en sådan struktur kommer beläggningen av en utbytbar deuteriumatom i en kristall att förfinas från 0-100 %, vilket direkt kvantifierar mängden utbyte.
Ansökningar
Neutronspridning
Perdeuterering av en komponent i ett flerkomponentsystem kan ge kontrast för neutronspridningsexperiment , där kontrasten som erhålls genom att använda deutererade lösningsmedel är otillräcklig. [ citat behövs ]
Proteinstruktur
Det är inte möjligt att bestämma strukturen för ett protein med H/D-utbyte annat än neutronkristallografi och det är inte heller möjligt att definiera sekundära strukturella element. Orsakerna till detta är relaterade till det sätt på vilket proteinstrukturen bromsar utbytet. Växelkurser är en funktion av två parametrar: lösningsmedelstillgänglighet och vätebindning. Således kommer en amid som är en del av en intramolekylär vätebindning att bytas ut långsamt om alls, medan en amid på ytan av protein väte bundet till vatten kommer att utbytas snabbt. Amider begravda från lösningsmedlet men inte vätebundna kan också ha mycket långsamma växlingshastigheter. Eftersom både lösningsmedelstillgänglighet och vätebindning bidrar till utbyteshastigheten, blir det svårt att tillskriva en given växelkurs till ett strukturelement utan kristallografi eller NMR-strukturdata.
H-D-utbyte har använts för att karakterisera proteiners veckningsväg genom att återvecka proteinet under utbytesförhållanden. I ett framåtväxlingsexperiment (H till D) tillsätts en puls av deuterium efter olika mängder omveckningstid. De delar av strukturen som bildas snabbt kommer att skyddas och därmed inte bytas ut, medan områden som viker sig sent i vägen kommer att exponeras för utbytet under längre tid. Således kan H/D-utbyte användas för att bestämma sekvensen av olika vikningshändelser. Faktorer som bestämmer tidsupplösningen för detta tillvägagångssätt är effektiviteten av blandningen och hur snabbt härdningen kan utföras efter märkningen.
H–D-utbyte har använts för att karakterisera proteinstrukturer och protein–proteininteraktioner. Utbytesreaktionen måste utföras med de isolerade proteinerna och med komplexet. Utbytesregionerna jämförs sedan. Om en region begravs av bindningen kan amiderna i denna region skyddas i komplexet och utbytas långsamt. Man måste dock komma ihåg att H–D-utbyte inte kan användas för att lokalisera bindningsgränssnitt för alla protein-proteininteraktioner. Vissa protein-protein-interaktioner drivs av elektrostatiska krafter från sidokedjor och kommer sannolikt inte att ändra vätehastigheten för amidväten i ryggraden, särskilt om amidvätena är belägna i stabila strukturella element såsom alfaspiraler .
Slutligen kan H-D-utbyte användas för att övervaka konformationsförändringar i proteiner när de relaterar till proteinfunktion. Om konformationen förändras som ett resultat av posttranslationell modifiering , enzymaktivering, läkemedelsbindning eller andra funktionella händelser, kommer det sannolikt att bli en förändring av H/D-utbytet som kan detekteras.
HDXsite online webbserver
HDXsite är en webbserver online som inkluderar vissa applikationer som HDX-modeller som ökar upplösningen av experimentell HDX-data och modelleringsskyddsfaktorer för enskilda rester.
Vidare läsning
- David Weis, red. (2016). Väteutbytesmasspektrometri av proteiner: grunder, metoder och tillämpningar . New York: Wiley. ISBN 9781118616499 .
- Masson GR, Burke JE, Ahn NG, Anand GS, Borchers C, Brier S, et al. (juli 2019). "Rekommendationer för att utföra, tolka och rapportera väte-deuteriumutbytesmasspektrometri (HDX-MS) experiment" . Naturmetoder . 16 (7): 595–602. doi : 10.1038/s41592-019-0459-y . PMC 6614034 . PMID 31249422 .