Exopolyfosfatas
| Exopolyfosfatasidentifierare | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| _ | |||||||||
| EG nr. | 3.6.1.11 | ||||||||
| CAS-nr. | 9024-85-5 | ||||||||
| Databaser | |||||||||
| IntEnz | IntEnz-vy | ||||||||
| BRENDA | BRENDA inträde | ||||||||
| ExPASy | NiceZyme-vy | ||||||||
| KEGG | KEGG inträde | ||||||||
| MetaCyc | Metabolisk väg | ||||||||
| PRIAM | profil | ||||||||
| PDB- strukturer | RCSB PDB PDBe PDB summa | ||||||||
| Genontologi | AmiGO / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
Exopolyfosfatas (PPX) är ett fosfatasenzym som katalyserar hydrolysen av oorganiskt polyfosfat , en linjär molekyl som består av upp till 1000 eller fler monomerer sammanlänkade med fosfoanhydridbindningar. PPX är ett processivt exofosfatas, vilket innebär att det börjar i ändarna av polyfosfatkedjan och klyver fosfoanhydridbindningarna för att frigöra ortofosfat när det rör sig längs polyfosfatmolekylen. PPX har flera egenskaper som skiljer det från andra kända polyfosfataser, nämligen att det inte verkar på ATP , har en stark preferens för långkedjigt polyfosfat och har en mycket låg affinitet för polyfosfatmolekyler med mindre än 15 fosfatmonomerer.
PPX spelar en viktig roll i metabolismen av fosfat och energi i alla levande organismer. Det är särskilt viktigt för att upprätthålla lämpliga nivåer av intracellulärt polyfosfat , vilket har varit inblandat i en mängd olika cellulära funktioner inklusive svar på stressfaktorer som brister i aminosyror , ortofosfat eller kväve , förändringar i pH , nedväxling av näringsämnen och hög salthalt, och som en oorganisk molekylär chaperon . PPX klassificeras som ett polyfosfatas, som är en del av den stora DHH-fosfoesterasfamiljen. Båda underfamiljerna inom denna superfamilj delar fyra N-terminalmotiv men har olika C- terminaldelar .
PPX-aktiviteten kvantifieras genom att mäta förlusten av radioaktivt märkt 32P - polyfosfat . PPX blandas med en känd mängd märkt polyfosfat och hydrolysreaktionen stoppas med perklorsyra (HClO 4 ). Mängden kvarvarande märkt polyfosfat mäts sedan genom vätskescintillationsräkning .
Historia
PPX upptäcktes av nobelpristagaren Arthur Kornbergs labb 1993 och är en del av polyfosfatoperonet tillsammans med polyfosfatkinas , enzymet som syntetiserar polyfosfat . Kornberg-labbet var mycket intresserad av polyfosfat och publicerade en serie artiklar som klargjorde metabolismen och rollerna för polyfosfat in vivo . Deras intresse för polyfosfat ledde till att de identifierade och karakteriserade polyfosfatoperonet (som inkluderar polyfosfatkinas [PPK] och PPX) och utvecklade en mängd olika analyser och tekniker för kvantifiering av polyfosfatproduktion och nedbrytning, in vitro och in vivo . Resultaten av dessa studier av polyfosfat av Kornberg-laboratoriet fick Kornberg att spekulera i att polyfosfat på grund av dess höga energi- och fosfatinnehåll och graden av konservering mellan arter kan ha varit prekursorn till RNA , DNA och proteiner .
Strukturera
Strukturen hos PPX kännetecknas av den aktinliknande ATPas -domänen som är en del av denna superfamilj. I Aquifex aeolicus innehåller den ett ribonukleas H-liknande motiv som är uppbyggt av ett femsträngat β -ark med den andra strängen antiparallell med resten. Ett fåtal av strängarna är förbundna med spiralformade segment som är längre i den C-terminala domänen än i den N-terminala domänen. Fem alfa-helixar är belägna i den C-terminala domänen och endast två är belägna i den N-terminala domänen. Enzymets slutna konfiguration kallas typ I-strukturen. Denna konfiguration delar liknande egenskaper som andra medlemmar av denna superfamilj, inklusive de N-terminala och C-terminala domänerna som är åtskilda av två alfa-helixar centrerade på strukturen. Det öppnare arrangemanget av domänerna visar rotationsrörelse för de två domänerna runt ett enda gångjärnsområde. Den strukturella flexibiliteten har beskrivits som en "fjärilsliknande" klyfta öppning runt den aktiva platsen .
I E. coli existerar exopolyfosfatas som en dimer , där varje monomer består av fyra domäner. De två första domänerna består av tre beta-ark följt av en alfa-beta-alfa-beta-alfa-veck. Detta skiljer sig från den tidigare beskrivna Aquifex aeolicus -homologen som saknar den tredje och fjärde domänen. Hittills har 4 strukturer lösts för denna klass av enzymer, med proteindatabankens accessionskoder 1T6C , 1T6D , 1U6Z och 2FLO .
Aktiv sida
Det aktiva stället för exopolyfosfatas är beläget i klyftorna mellan domänerna I och II. I E. coli innehåller denna region en slinga mellan strängarna beta-1 och beta-2 med aminosyrorna glutamat och aspartat (E121, D143 och E150). Dessa rester, tillsammans med K197, är kritiska för fosfatbindning och jonbindning, vilket vanligtvis ses bland andra ASKHA (acetat- och sockerkinaser, Hsp70 , aktin ). Hos A. aeolicus finns enzymets aktiva ställe i en klyfta mellan de två domänerna. Man ser att katalytiska karboxylgrupper i denna klyfta är viktiga för enzymaktiviteten, speciellt Asp141 och Glu148. Preferensen för exopolyfosfatas att binda till polyfosfat och inte ATP har bidragit till den konflikt som skulle uppstå mellan ribosen och adenosinet i ATP och sidokedjorna av N21, C169 och R267.
Mekanism
Exopolyfosfatas klyver ett terminalt fosfat från polyfosfat genom aminosyrasidokedjorna av glutamat och lysin. Glutamat aktiverar vatten, vilket gör att det kan fungera som en nukleofil och attackera det terminala fosfatet. Syret som tidigare överbryggade de två fosfatatomerna tar sedan bort ett väte från den närliggande lysinresten.
Fungera
Polyfosfater används av exopolyfosfatasenzymer, som klyver delar av fosfatkedjan. Dessa proteiner spelar en viktig roll i metabolismen och underhållet av polyfosfater. Polyfosfat finns i hela cytosolen i varje cell och finns också i cellens organeller . Det finns många klasser av exopolyfosfataser, var och en med sin egen unika lokalisering och egenskaper. Det har spekulerats i att när polyfosfaterna väl bryts ned är de involverade i signalmolekyler som fungerar som sekundära budbärare . I E. coli är regleringen av polyfosfatmetabolism dåligt förstådd.
Polyfosfat är en linjär kedja av fosfater som är sammanlänkade genom fosfoanhydridbindningar. Polyfosfat finns i alla levande organismer och spelar en viktig roll för organismens överlevnad. I bakterier används polyfosfat för att lagra energi för att ersätta adenosintrifosfat . Det har också visat sig vara involverat i cellmembranbildning och funktion, enzymreglering och gentranskriptionell kontroll. Hos däggdjur är polyfosfater involverade i blodkoagulation och inflammation, immunsvar, benvävnadsutveckling och hjärnfunktion.
Det har visats i en jästmodell att mutant jäst med brist på exopolyfosfatasaktivitet hade problem med andningsfunktioner och metabolism av oorganiska polyfosfater. Omvänt har jäststammar som har högre nivåer av exopolyfosfatasenzym inte visat sig ha några uppenbara tillväxtdefekter under fosfatbrist eller överskott av fosfatförhållanden, men nivån av polyfosfat i jästen var mycket lägre på grund av det ökade antalet enzymer som bryter ner polyfosfatkedjorna.
Potentiell klinisk/industriell relevans
E. coli -mutanter som inte kan syntetisera polyfosfat dör efter bara några dagar i stationär fas . Strategier för att hämma polyfosfatackumulering i bakterier är därför av intresse som potentiella antibakteriella behandlingar. Detta kan åstadkommas via inhibering av polyfosfatkinas, förstärkning av exopolyfosfatasaktivitet eller båda.
Polyfosfatackumulering är också av intresse för en mängd olika industriella tillämpningar inklusive avlägsnande av Pi från vattenmiljöer via förbättrat biologiskt fosforavlägsnande och för dess roll som en molekylär chaperon vid uttryck av rekombinant protein . På grund av aktiviteten av polyfosfat som en molekylär chaperon kan stammar av E. coli som ackumulerar polyfosfat användas för att öka utbytet av lösligt rekombinant protein .
Rekombinant exopolyfosfatas från Saccharomyces cerevisiae skyddar mot dödlighet och återställer skyddande immunsvar i prekliniska sepsismodeller.
