BacMam
Bac ulovirus -genöverföring till däggdjursceller , känd från vetenskapliga forskningsartiklar som BacMam , är användningen av baculovirus för att leverera gener till däggdjursceller . Baculovirus är insektscellvirus som kan modifieras för att uttrycka proteiner i däggdjursceller. Det omodifierade baculoviruset kan komma in i dessa celler, men dess gener uttrycks inte om inte en igenkännbar promotor från däggdjur är inkorporerad uppströms om en gen av intresse. Både omodifierat baculovirus och dess modifierade motsvarighet är oförmögna att replikera i människor och är således icke-smittsamma.
Uppfunnet av Dr. Frederick M. Boyce, BacMam är en bakulovirusmedierad genöverföringsteknik som har vunnit utbredd användning på grund av fördelar jämfört med andra transfektionsmetoder (för recensioner se Kost, TA et al .). Dessutom har BacMam visat sig ha inneboende flexibilitet gentemot stabila cellinjer , vilket har bidragit till dess antagande som en standardteknik för genöverföring.
Generella egenskaper
BacMam-genleveransteknologin är ett transient expressionssystem som underlättar expression av toxiska genprodukter. Den har ett brett spektrum av transduktion inklusive många primära celltyper och stamceller . Det baculovirala genomet har en stor kapacitet för insättning av främmande gen med upp till 38 kb har prövats framgångsrikt. Samtidig leverans av flera gener till samma cell är möjlig. Det finns få eller inga mikroskopiskt observerbara cytopatiska effekter av BacMam-partiklar på däggdjursceller. Nivån av genuttryck kan justeras genom viral dos eller kemiska tillägg med hjälp av histon-deacetylashämmare. Transduktion av celler utförs genom tillsats av endast vätska och därför är BacMam mottaglig för automatiserade metoder. Slutligen är virus stabila när de förvaras vid 4 ° C i mörker under långa perioder.
Biosäkerhetsöverväganden
Baculovirus är riskgrupp 1-medel som har använts i stor utsträckning i över 25 år för produktion av insektscellprotein . Baculovirus produceras i insektsceller och är oförmögna att replikera i däggdjursceller och är inte kända för att orsaka sjukdom hos friska vuxna människor. Dessutom inaktiveras BacMam-virus av mänskligt komplement, vilket minskar risken för forskare. Slutligen kan virus som används i laboratoriet inte replikera i insekter så det finns inget miljöhot från dessa partiklar som oavsiktligt släpps ut i miljön.
Viralt inträde
Studier av baculovirus inträde i humana hepatocellulära karcinomceller tyder på att BacMam kommer in i däggdjursceller via clathrin-medierad endocytos och möjligen via makropinocytos. Ytterligare studier har föreslagit att kaveoler på något sätt är involverade i baculovirus inträde i däggdjursceller.
Värdcellssvar
För att vara effektiv får en genleveransteknologi inte störa normal cellulär funktion. Cytotoxicitetsanalyser och transkriptomanalyser på en human HEK-cellinje (HEK293) har avslöjat att baculovirustransduktion inte är cytotoxisk och inte inducerar differentiella transkriptionssvar. På liknande sätt behåller infekterade Schwann-celler sin karakteristiska morfologiska och molekylära fenotyp och kan differentiera in vitro och uttrycka P0- myelineringsmarkören . Genom att använda komplementär DNA (cDNA) mikroarrayteknologi för att undersöka in vitro och in vivo globala cellulära genuttrycksprofiler i råtthjärnan, odlade mänskliga astrocyter och mänskliga neuronala celler efter viral transduktion, observerades värdantivirala svar. De relaterade generna var huvudsakligen de som är associerade med medfödd immunitet, inklusive flera av generna som är involverade i Toll-liknande receptorsignalväg och cytokin -cytokinreceptorinteraktion.
- Bioproduktion
- BacMam har använts för att producera proteiner i stora mängder med hjälp av HEK293-celler i ett med ihåliga fibrer
- Farmakologi av G-proteinkopplad receptor är möjlig med användning av BacMam-teknologi i läkemedelsupptäcktstillämpningar bioreaktorsystem
- High Throughput Screening
- Fluorescensmikroskopi
- Organellmärkningsreagenser är kommersiellt tillgängliga BacMam-partiklar för märkning av organeller och andra subcellulära strukturer
- Enstaka mitokondrier märkt med ett mitokondriellt målriktat grönt fluorescerande protein
- Receptoraktivering/väganalys
- Karakterisering av serotoninreceptoraktivering via en BacMam-levererad GFP-fusion till ett kinassubstrat.
- Strukturell biologi
- BacMam-system har använts för att producera solsystem. membranglykoproteiner för strukturella studier