Nukleär mitokondrie DNA-segment

NUMT , uttalas "new might", är en akronym för " nu clear m i t ochondrial DNA"-segment myntat av evolutionär genetiker, Jose V. Lopez , som beskriver en transponering av vilken typ av cytoplasmatisk mitokondriell DNA som helst till kärngenomet hos eukaryota organismer . .

Fler och fler NUMT-sekvenser, med olika storlek och längd, i det olika antalet eukaryoter, har upptäckts när mer helgenomsekvensering av olika organismer ackumuleras. Faktum är att NUMT ofta oavsiktligt upptäckts av forskare som letade efter mtDNA ( mitokondriellt DNA) . NUMTs har rapporterats i alla studerade eukaryoter, och nästan alla mitokondriella genomregioner kan integreras i kärngenomet. Men NUMT skiljer sig i antal och storlek mellan olika arter. Sådana skillnader kan förklaras av interspecifik variation i sådana faktorer som könslinjestabilitet och mitokondrierantal. Efter frisättningen av mtDNA till cytoplasman , på grund av mitokondriella förändringar och morfologiska förändringar, överförs mtDNA till kärnan med en av de olika förutspådda metoderna och infogas så småningom genom dubbelsträngade brottreparationsprocesser i kärn-DNA (nDNA) . Inte bara har någon korrelation hittats mellan fraktionen av icke-kodande DNA och NUMT-överflöd i genomet, utan NUMT har också visat sig ha icke-slumpmässig fördelning och en högre sannolikhet att infogas på den specifika platsen för genomet jämfört med andra. Beroende på platsen för insättningen kan NUMT störa funktionen hos generna. Dessutom har De novo-integrering av NUMT-pseudogener i kärngenomet en negativ effekt i vissa fall, vilket främjar olika störningar och åldrande.

Den första tillämpningen av NUMT-termen i tamkattexemplet ( Felis catus ) var slående, eftersom mitokondriernas gennummer och innehåll amplifierades 38-76X i kattens kärngenom, förutom att de transponerades från cytoplasman. Kattens NUMTs sekvenser verkade inte vara funktionella på grund av upptäckten av flera mutationer, skillnaderna i mitokondriella och nukleära genetiska koder och den uppenbara insättningen inom typiskt inerta centromerregioner. Närvaron av NUMT-fragment i genomet är inte problematisk i alla arter; till exempel visas det att sekvenser av mitokondriellt ursprung främjar nukleär DNA-replikation i Saccharomyces cerevisiae . Även om den utökade translokationen av mtDNA-fragment och deras samförstärkning med fritt mitokondriellt DNA har varit problematisk vid diagnosen av mitokondriella störningar, i studien av populationsgenetik och fylogenetiska analyser , har forskare använt NUMTs som de genetiska markörerna för att ta reda på relativ hastighet av nukleär och mitokondriell mutation och återskapande av det evolutionära trädet.

År 2022 rapporterade forskare upptäckten av pågående överföring av mitokondrie-DNA till DNA i cellkärnan . Tidigare troddes NUMT ha uppstått för länge sedan . 66 tusen helgenomsekvenser indikerar att detta för närvarande inträffar så ofta som en gång i varje ~4 000 mänskliga födslar.

Historia

Enligt endosymbios-teorin , som fick acceptans runt 1970-talet, var mitokondriet , som en viktig energifabrik i cellen, tidigare en frilevande prokaryot som invaderade en eukaryot cell. Enligt denna teori överförde symbiotiska organeller gradvis sina gener till det eukaryota genomet, vilket antyder att mtDNA gradvis integrerades i kärngenomet. Trots metaboliska förändringar och funktionella anpassningar i värdeukaryoterna, finns cirkulär mitokondrie-DNA i organellerna. Innehåller 37 gener, mitokondriellt DNA har en viktig roll i produktionen av nödvändiga föreningar, såsom nödvändiga enzymer för att mitokondrierna ska fungera korrekt. Specifikt har det föreslagits att vissa gener (såsom generna för cytokromoxidassubenheter I och II) inom organellen är nödvändiga för att reglera redoxbalansen genom membranassocierade elektrontransportkedjor. Dessa delar av mitokondriernas genom har rapporterats vara de mest använda. Mitokondrier är inte den enda platsen där cellens mtDNA, mitokondrie-DNA, kan hittas; ibland kan överföring av mitokondrie-DNA från organeller till kärnan ske; bevisen för sådan translokation har setts genom jämförelsen av mitokondriell DNA-sekvens med genomsekvensen för motsvarigheterna. Integreringen och rekombinationen av cytoplasmatiskt mtDNA i kärn-DNA kallas nukleärt mitokondriellt DNA, som förkortas NUMT.

Den möjliga närvaron av organell-DNA inuti kärngenomet föreslogs efter fynd av homolog struktur till mitokondrie-DNA, vilket var kort efter upptäckten av närvaron av ett oberoende DNA i organellerna 1967. Detta ämne förblev orörd fram till 1980-talet. Inledande bevis för att DNA kunde röra sig bland cellutrymmen kom när fragment av kloroplast-DNA hittades i majs mitokondriella genom med hjälp av korshybridisering, mellan kloroplast och mitokondrie-DNA, och fysisk kartläggning av homologa regioner. Efter denna första observation myntade Ellis namnet "promiskuöst DNA" för att beteckna överföringen av DNA intracellulärt från en organell till den andra och är närvaron av organell-DNA i flera cellulära fack. Detta är inte bara en viktig upptäckt i sig, utan är också mycket informativ och användbar för att förstå den evolutionära processen och den tidsperiod som olika händelser kan äga rum. Sökandet efter mtDNA i nukleärt DNA fortsatte fram till 1994 då den nyligen anmärkningsvärda transponeringen av 7,9 kb av ett typiskt 17,0 kb mitokondriegenom till en specifik nukleär kromosomal position i huskatten rapporterades. Detta är den tid då NUMT myntades för att beteckna de stora sträckorna av mitokondriellt DNA i genomet.

Hittills har hela genomen från många eukaryoter, både ryggradsdjur och ryggradslösa djur, sekvenserats och NUMT observerades i kärngenomet hos olika organismer, inklusive jäst, Podospora , sjöborre , gräshoppor , honungsbi, Tribolium , råtta, majs , ris och primater . I Plasmodium, Anopheles gambiae och Aedes aegypti myggor kan NUMT knappt detekteras. Däremot har de konserverade fragmenten av NUMT nu få identifierats i genomdata för Ciona intestinalis , Neurospora crassa , Schizosaccharomyces pombe , Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster och Rattus norvegicus . Antunes och Ramos upptäcktes närvaron av NUMT i fiskgenomet för första gången 2005 med användning av BLAST N, MAFFT , mycket kraftfulla genomkartläggningar och fylogenisk analys. Över hela djurriket Apis mellifera , från phylum Arthropoda , och Hydra magnipapillata , från phylum Cnidaria , de första respektive andra djuren med det högsta förhållandet av NUMTs till den totala storleken av kärngenomet medan Monodelphis Domestica , eller Gray short-tailed opossum , är rekordhållare för NUMT-frekvens bland ryggradsdjur. I likhet med djur är NUMTs rikligt förekommande i växterna och det längsta NUMT-fragmentet känt hittills, en 620-kb delvis duplicerad insättning av 367-kb mtDNA från Arabidopsis thaliana , rapporterades.

Mekanism för NUMT-insättning

NUMT-insättning i kärngenomet och dess uthållighet i kärngenomet initierad av fysisk leverans av mitokondriellt DNA till kärnan. Detta steg följer av mtDNA-integration i genomet genom en icke-homolog ändbindningsmekanism under reparationsprocess för dubbelsträngbrott ( DSB), som föreställts genom att studera bagerijäst, Saccharomyces Cerevisiae; och avslutas genom intragenomisk dynamik av amplifiering, mutation eller deletion, vilket också är känt som post-insertion modifieringar. Mekanismen för mtDNA-överföring till kärnan är ännu inte helt klarlagd.

Olika sätt mtDNA rör sig in i kärnan

Överföring av frisatt mtDNA till kärnan: Det första steget i överföringsprocessen är frisättningen av mtDNA till cytoplasman. Thorsness och Fox demonstrerade hastigheten för omlokalisering av mtDNA från mitokondrier in i kärnan med hjälp av ura3- jäststam med en konstruerad URA3 - plasmid , nödvändig gen för uracilbiosyntes, i mitokondrierna. Under förökningen av sådana jäststammar som bär på en nukleär ura3-mutation , kompletterar plasmid-DNA som flyr från mitokondrien till kärnan den biosyntetiska uracildefekten, återställer tillväxten i frånvaro av uracil, och lätt poängsatt fenotyp. Hastigheten för DNA-överföring från mitokondrierna till kärnan uppskattades till 2 x 10-5 ^per cell per generation medan det motsatta, i fallet med cox2 -mutanter, hastigheten för överföringen av plasmid från kärnan till mitokondrierna uppenbarligen är vid minst 100 000 gånger mindre. Många faktorer styr hastigheten för mtDNA-flykter från mitokondrier till kärnan. Den högre mutationshastigheten i mtDNA i jämförelse med nDNA i cellerna hos många organismer är en viktig faktor som främjar överföringen av mitokondriella gener till kärngenomet. En av de intergena faktorerna resulterar i den högre destruktionshastigheten för mitokondriella makromolekyler, inklusive mtDNA, är närvaron av hög nivå av reaktiva syrearter (ROS), genererade i mitokondrier som biprodukter i ATP-syntesmekanismen. Några andra faktorer som påverkar flykten av mtDNA från mitokondrier inkluderar verkan av mutagena ämnen och andra former av cellulär stress som kan skada mitokondrier eller deras membran, vilket bevisar att det är möjligt att anta att exogena skadliga ämnen (joniserande strålning och kemiska genotoxiska ämnen) ökar hastigheten för mtDNA-flykt in i cytoplasman. Thorsness och Fox fortsatte sin forskning för att hitta de endogena faktorerna som påverkar mtDNA-flykten in i kärnan. De isolerade och studerade 21 nukleära mutanter med olika kombinationer av mutationer i minst 12 nukleära loci som kallas yme (jäst mitokondriella flykt) mutationer, under olika miljöförhållanden eftersom vissa av dessa mutationer orsakar temperaturkänslighet. De upptäckte dessa mutationer som stör mitokondriella funktioner, på grund av förändringar av genprodukter, påverkar mitokondriell integritet och ledde till att mtDNA flyr till cytoplasman. Dessutom ändrar defekter i proteinerna hastigheten för mtDNA-överföring till kärnan. Till exempel, i fallet med yme1- mutant, riktas onormala mitokondrier för nedbrytning av vakuolen, med hjälp av pep4 , ett stort proteinas, och nedbrytning ökar mtDNA-flykten till kärnan genom processen med mitofagi. Dessutom fann Thorsness och Campbell att genom störning av pep4 minskar frekvensen av mtDNA-flykt i yme1 -stammar. På liknande sätt sänker störningen av PRC1 , som kodar för karboxipeptidas Y, hastigheten för mtDNA-flykt i yme1 -jäst.; Bevis visar att mitofagi är ett av de möjliga sätten för mtDNA-överföring till kärnan och fastställts vara den mest stödda vägen hittills. Några andra möjliga vägar visas i figur 1. Den första vägen, som det förklarades, är en yme1 -mutant som resulterar i inaktivering av YMe1p- protein, ett mitokondriellt lokaliserat ATP-beroende metalloproteinas , vilket leder till hög flykthastighet av mtDNA till kärnan . Mitokondrier från yme1- stammen tas upp för nedbrytning av vakuolen oftare än vildtypsstammen. Dessutom har cytologiska undersökningar föreslagit flera andra möjliga vägar i det olika antalet arter , inklusive en lysering av mitokondriella avdelningen, direkt fysisk anslutning och membranfusion mellan mitokondrier och kärna, och inkapsling av mitokondriella avdelningar inuti kärnan, som visas i figur 1 .
Förberedelse före insättning Olika möjliga sätt att bearbeta mtDNA före insättning i nDNA: Efter att ha nått kärnan måste mtDNA komma in i kärngenomet. Hastigheten för mtDNA-inkorporering i kärngenomet kan förväntas bero på DSB-numret i nDNA, aktiviteten hos DSB-reparationssystem och hastigheten för mtDNA-flykt från organeller. MtDNA-insättning innefattar tre huvudprocesser, som visas i figur 2; För det första måste mtDNA:t ha rätt form och sekvens; med andra ord måste mtDNA:t redigeras vilket ger upphov till det nya redigerade stället i polynukleotidstrukturen. Mitokondriellt DNA är inte universellt och hos djur som liknar växter visar mitokondriell redigering mycket oberäkneliga mönster av taxonspecifik förekomst.; Som visas i figur 2 finns det tre möjliga sätt som mtDNA kan förberedas för att infogas i det nukleära DNA:t. Processen beror huvudsakligen på den tid mtDNA överförs till kärnan. Som visas i figur 2b är direkt integrering av oredigerade mtDNA-fragment i kärngenomen den mest troliga och bevisen finns både i växter, Arabidopsis-genomet och djur med hjälp av olika metoder, inklusive BLAST-baserad analys. I detta fall överförs mtDNA till kärnan varvid redigering och introner uppstår i mitokondrien senare. Om en gen, till exempel, överfördes till kärnan i en linje innan mitokondriell redigering utvecklades, men stannade kvar i organellen i andra linjer där redigering uppstod, skulle kärnkopian se ut mer lik ett redigerat transkript än de återstående mitokondriekopiorna vid de redigerade webbplatserna. En annan representerad och mindre stödd modell, figur 2a, är den cDNA -medierade modellen, vilken introninnehållet mtDNA kommer in i kärnan och genom omvänd transkription av splitsad och redigerad mitokondrietranskript blir den integrerad i nDNA:t. Den tredje föreslagna mekanismen är direkt överföring och integration av intronlöst mtDNA i kärnan, figur 2c, varvid redigering och introner i mitokondrien kommer och går under evolutionen. I det här fallet sker introduktionen och avlägsnandet av intronen, såväl som omvänd transkription inom mitokondrier och slutprodukten, det redigerade intronlösa mtDNA:t, kommer att integreras i nDNA efter att ha överförts till kärnan.
Insertion i kärngenomet Mekanism för NUMT-insättning i kärn-DNA: Efter att det förberedande steget är över är mtDNA redo att infogas i kärngenomet. Baserat på NUMT-integreringsstället och de analyserade resultaten från bagerijästexperiment, antog Blanchard och Schmidt att mtDNA infogas i den dubbelsträngade brytningen (DSB) via icke-homologa ändsammanfogningsmaskiner. Hypotesen visar sig vara allmänt accepterad. Senare analyser överensstämde med involveringen av NHEJ i NUMT-integration hos människor. Dessa processer sker i både somatiska celler och könsceller . Hos djur och människor beror emellertid förmågan till DSB-reparation i könsceller på det oogenetiska och spermatogenetiska stadiet, men på grund av den låga reparationsaktiviteten är mogna spermier inte kapabla till DSB-reparation. Dessutom kan DSB också repareras genom homolog rekombination (HR), vilket är mer exakt och introducerar färre fel i reparationsprocessen, medan det ännu inte har setts i processen för mtDNA-insättning;. Förutom kanonisk NHEJ repareras DSB:er via en mekanism som involverar sekvenser som innehåller några homologa nukleotider i ändarna av en DSB som ska ligeras. Denna mekanism är känd som mikrohomologiförmedlad ändfogning, förkortat MMEJ. MMEJ är den mest mutagena DSB- reparationsmekanismen på grund av generering av deletioner, insättning av olika storlekar och andra genomomarrangemang hos däggdjur.; Såsom visas i figur 3 inkluderar processerna för mtDNA-insättning och DSB-reparation några steg som är DNA-segmentanpassning, DNA-ändbearbetning, DNA-syntes och ligering. I varje steg krävs vissa proteinkomplex för att underlätta förekomsten av de indikerade händelserna. Som visas i figur 3, i NHEJ, Ku70/Ku80- heterodimeren och DNA-beroende proteinkinas (DNA-PK), för att föra DNA-fragments ändar samman, Artemis nukleas och polynukleotidkinas 3' fosfatas ( PNKP) , för slutbearbetningen , X-familjens DNA-polymeraser (Pol μ och Pol λ) och terminalt deoxinukleotidyltransferas (TdT) , för DNA-syntes, och XLF/XRCC4/LigIV- komplex, för att fullborda reparationen och sammanfoga ändarna via en fosfodiesterbindning, är de involverade proteinkomplexen i DSB reparationsprocess i många högre organismer. DNA-polymeraser (Pol μ och Pol λ) och XLF/XRCC4/LigIV- komplex delas mellan två NHEJ- och MMEJ-reparationsmaskiner och har samma ansvar i båda reparationsprocesserna. Det första steget av MMEJ görs av WRN- , Artemis-, DNA-PK- och XRCC4 -proteinkomplex som bearbetar ändarna av DSB- och mtDNA-fragment förutom att anpassa dem för att polymeraser och ligaser ska kunna slutföra NUMT-insättning (figur 3) ).
Modifiering efter insättning: Det komplexa mönstret av NUMT i jämförelse med den enda mitokondriella delen, uppkomsten av icke-kontinuerligt mitokondriellt DNA i kärngenomet och möjligen olika orientering av dessa fragment är beviset på processer efter insättning av NUMT inom kärngenomet. Orsaken till dessa komplexa mönster kan vara resultatet av flera NUMT-infogningar vid insättningshotspots. Dessutom bidrar duplicering efter insättning till NUMT-mångfald. NUMTs har ingen självreplikerande mekanism eller transponeringsmekanism; därför förväntas NUMT-duplicering ske i tandem eller involvera större segmentell duplicering med hastigheter som är representativa för resten av genomet. Bevis för NUMT-dupliceringar som inte är i närheten av andra NUMTs finns i många genom och sker förmodligen som en del av segmentell duplicering. Dupliceringar av nyare mänskliga specifika NUMTs som en del av segmentell duplicering verkar dock vara sällsynta; hos människor visar sig endast ett fåtal NUMTs ha överlappning med segmentell duplicering, och dessa NUMTs hittades i endast en av kopiorna medan de saknades från de andra, vilket tydligt visar att NUMT:erna infogades efter dupliceringshändelserna. Borttagning är en annan NUMT modifieringsmetod efter insättning som ännu inte har studerats i samma detalj som en infogning. Konstant erosion av fylogena signaler och hög mutationshastighet i djurs mtDNA gör igenkänning av sådan modifiering, särskilt deletion, svår. Att studera de fall där närvaron-frånvaronmönstret av NUMTs inte stämmer överens med det fylogenetiska trädet , bör göra det möjligt att detektera de senaste NUMT-förlusterna genom att använda flera genomanpassningar med närvaron av en utgrupp. Bensasson och hans teammedlemmar använde denna metod för att uppskatta det äldsta insatta NUMT i människa, som daterades för cirka 58 miljoner år sedan.

Allmänna egenskaper hos NUMT

Eftersom antalet mitokondrier och deras funktionella nivå skiljer sig mellan eukaryota organismer, varierar längden, strukturen och sekvensen av NUMTs dramatiskt. Forskare har funnit att de senaste NUMT-insättningarna härrör från olika segment av det mitokondriella genomet, inklusive D-loopen och, i vissa extrema fall, ett antal, nästan, det mitokondriella genomet i full längd. Sekvensen, frekvensen, storleksfördelningen och till och med svårigheterna att hitta dessa sekvenser i genomet varierar avsevärt mellan arter. Majoriteten av DNA-fragment som överförs från mitokondrier och plastider till kärngenomet är mindre än 1 kb stora. Ändå finns extremt stora fragment av organell-DNA i vissa växtgenom.

Eftersom genomet utvecklas och förändras över tiden genom mutation, skiljer sig antalet NUMT i genomet under evolutionens gång. NUMT går in i kärnan och infogar i nDNA vid olika skeden av tiden. På grund av konstant mutation och instabilitet av NUMT varierar likheten mellan denna genomsträckning och mtDNA:t över hela riket Animalia och även inom det vissa genomet. Till exempel är det senaste antalet NUMT som registrerats i det mänskliga genomet 755 fragment som sträcker sig från 39 bp till nästan hela mitokondriella sekvensen i storlek. Det finns 33 paraloga sekvenser med över 80 % sekvenslikhet och med en större längd än 500 bp. Dessutom är inte alla NUMT-fragmenten i genomet resultatet av mtDNA-migrering; vissa är resultatet av amplifiering efter insättning. Gamla NUMTs har visat sig vara rikligare i det mänskliga genomet än de senaste integranterna, vilket indikerar att mtDNA kan amplifieras när det väl har infogats. Dayama et al. utvecklat en ny teknik med hög avkastning för exakt detektering av antalet NUMT i det mänskliga genomet som kallas dinumt . Denna metod gör det möjligt för henne och hennes teammedlemmar att identifiera NUMT-insättningar, av alla storlekar, i hela genomen som sekvenseras med hjälp av parad-end-sekvenseringsteknologi med större känslighet. De tillämpade dinumt på 999 individer från 1000 Genomes Project och Human Genome Diversity Project ( HGDP) och genomförde en uppdaterad anrikningsanalys hos människor med dessa polymorfa insättningar. Ytterligare undersökningar och genotypning av det upptäckta NUMT analyserar också ålder för insättning, ursprung och sekvensegenskaper. Slutligen bedömde de deras potentiella inverkan på pågående studier av mitokondriell heteroplasmi.

Som tidigare nämnts sätts mtDNA in i det nukleära genomet endast när en DSB produceras av endogena eller exogena skadliga faktorer. Men mtDNA infogas inte på någon plats i genomet. Dessutom finns det ingen korrelation mellan fraktionen av icke-kodande DNA och NUMT-överflöd; Dessutom fann Antunes och Ramos att gamla NUMT: er infogas preferentiellt i de kända och förutspådda loci, som antas för nya NUMTs i det mänskliga genomet, under deras kraftfulla arbete med NUMT-sekvens i fiskar med hjälp av BLASTN-analysmetoden. Baserat på dessa studier visar sig därför införandet av NUMT i kärngenomet vara icke-slumpmässigt. En av de bästa studierna som bevisar den icke-slumpmässiga distributionen och infogningen av NUMTs i kärngenomet är gjord av Tsuji och hans lagkamrater. Genom att använda LAST-metoden istället för BLAST, som gör det möjligt att beräkna E-värde med högre noggrannhet och inte underrepresenterar de repetitiva elementen i NUMT-flankerna, kunde Tsuji och hans lagkamrat karakterisera platsen för NUMT-insättningen exakt. De fick reda på att NUMT-fragment tenderar att infogas i regioner med hög lokal DNA-krökning eller böjbarhet och hög A+T-rika oligomerer, särskilt TAT. Dessutom infogas NUMTs mestadels i öppna kromatinregioner. Med samma metod visade Tsuji att NUMTs vanligtvis inte klustrades ihop och NUMTs som produceras av D-loop är vanligtvis underrepresenterade, vilket är tydligare hos apor och människor jämfört med råttor och mus på grund av den totala längden på deras NUMT. Men Tsuji fann också att retrotransposonstrukturen är starkt berikad i NUMT-flanker och de flesta NUMT infogas i omedelbar närhet av retrotransposon medan endast ett fåtal, 10 av 557 NUMT, infogades i en retrotransposon, de kunde inte hitta någon tydlig relation till storleken på icke-kodande DNA och antalet NUMT.

Konsekvenser av de novo-integrering av NUMT-inlägg

NUMT är inte helt funktionslösa och vissa funktioner associeras med dem. Även om införandet av NUMTs tidigare ansågs vara funktionslösa pseudogener, har nya mänskliga NUMTs visat sig vara en potentiellt mutagen process som kan skada den funktionella integriteten hos det mänskliga genomet. Ackumuleringen av mutation i NUMT, post-insertionell förändring, mutagen mekanism för NUMT-insertion, MMEJ och NHEJ, DSB, såväl som den plats där insättningshot spot är belägen kan orsaka mutation och dramatiska förändringar av genomstrukturen vid integrationsplatsen interfererar med genomets funktion och utövar betydande effekter på uttrycket av genetisk information. Dessutom påverkar integration av mtDNA-sekvenser väsentligt den rumsliga organisationen av nDNA och kan spela en viktig roll i utvecklingen av eukaryota genom. Förutom den negativa effekten av mtDNA, kommer de konserverade gamla NUMTs i genomet sannolikt att representera evolutionära framgångar och de bör betraktas som en potentiell evolutionär mekanism för att förbättra genomiska kodande regioner. Dessutom fann Chatre och Ricchetti med användning av tvådimensionell gelelektrofores , plasmidkonstruktion , mutagenes , i en silico-analys av ACS- motiv och plasmidförlusthastighetsanalys att migrerande mitokondriella DNA kan påverka replikeringen av kärnområdet där de är insatt. Genom sina funktionella bevis visade de att sekvenser av mitokondriellt ursprung främjar nDNA-replikation i Saccharomyces cerevisiae . NUMTs är rika 11-bp ARS -kärna-A-konsensussekvens (ACS), som dess närvaro i matchningarna till dessa konsensusmotiv, i Saccharomyces cerevisiae -replikationsstartpunkten, är nödvändig men inte tillräcklig för funktionen av replikationsursprung och eventuell mutation i denna konsensus orsakar minskning eller förlust av DNA-replikationsaktivitet. Med tanke på den höga tätheten av ACS-motiv verkar vissa NUMTs huvudsakligen som ACS-bärare. Däremot är replikationseffektiviteten högre i de jäststammar som har plasmider som innehåller både NUMT och ARS. De fann också att vissa NUMTs kan fungera som en oberoende replikationsgaffel och sena kromosomala ursprung och NUMTs som ligger nära eller inom ARS tillhandahåller nyckelsekvenselement för replikering. Således kan NUMTs fungera som oberoende ursprung, när de sätts in i ett lämpligt genomiskt sammanhang eller påverka effektiviteten hos redan existerande ursprung.

Sjukdomar och störningar

NUMT-insättning i genomet kan vara problematiskt. Transponering av NUMTs till genomet har också associerats med mänskliga sjukdomar. De novo-integrering av NUMT-pseudogener i kärngenomet har en negativ effekt i vissa fall, vilket främjar olika störningar och åldrande. MtDNA-integrering i kodande gener i könscellscellerna har dramatiska konsekvenser för embryonutvecklingen och är i många fall dödlig. Få NUMT-pseudogener associerade med sjukdomar finns inom exoner eller vid exon-intron-gränserna för mänskliga gener. Till exempel ärver patienter med mukolipidossyndrom en mutation orsakad av införande av ett 93bp-fragment av mitokondriell ND5 i exon 2 av R403C-mukolipingenen. Detta är det första fallet av en ärftlig sjukdom på grund av NUMT-inlägget. Trots den lilla behandlingsgruppen visade sig stamcellstransplantation vara effektiv och lysosomala enzymnivåer verkade normaliseras efter transplantation i minst ett fall. Pallister -Hall-syndromet , en utvecklingsstörning, i ett annat exempel, där en funktionell störning av en nyckelutvecklingsgen resulterar från en de novo- insättning av ett 72bp mtDNA-fragment i GLI3- exon 14 i kromosom 7 , vilket resulterar i central och postaxiell polydaktyli , bifid epiglottis, imperforerad anus, njuravvikelser inklusive cystiska missbildningar, njurhypoplasi , ektopisk ureteral implantation och pulmonella segmenteringsavvikelser såsom bilaterala tvålobade lungor. En skarvningsställemutation i den mänskliga genen för plasmafaktor VII som orsakar allvarlig plasmafaktor VII-brist, blödningssjukdom, är resultatet av en 251-bp NUMT-insättning. Som det senaste kända exemplet är en 36-bp-insättning i exon 9 av USH1C-genen associerad med Usher syndrom typ IC NUMT. Ingen säker förbannelse har ännu hittats för Ushers syndrom, men en aktuell klinisk studie på 18 frivilliga pågår för att fastställa påverkan av UshStat både på kort och lång sikt. Denna studie startades i september 2013 och beräknas vara klar i oktober 2023.

Åldrande

Flera studier indikerade att de novo förekomsten av NUMT-pseudogener i genomet av somatiska celler kan vara av etiologisk betydelse för karcinogenes och åldrande. För att visa sambandet mellan åldrande och NUMT i kärngenomet använde Cheng och Ivessa yme1-1 mutanta stammar av Saccharomyces Cerevisiae som har en högre hastighet av mtDNA-migrering. Metoden är exakt densamma som den metod som Thorsness och Fox använde för att bestämma de viktiga mekanismerna och faktorerna för mtDNA-migrering in i kärnan. De upptäckte att jäststammarna med förhöjda migrationshastigheter av mtDNA-fragment till kärnan visade accelererat kronologiskt åldrande, medan stammar med minskade mtDNA-överföringshastigheter till kärnan uppvisade en förlängd CLS, kronologisk livslängd som möjligen kan bero på effekten av NUMT på nukleära processer inklusive DNA-replikation, rekombination och reparation samt gentranskription. Effekten av NUMT på de högre eukaryota organismerna undersöktes av Caro och hans lagkamrater i råttorna som en modellorganism. Genom att använda en realtids-PCR-kvantifiering, in situ hybridisering av mtDNA till nDNA och jämförelse av unga och gamla råttor, kunde Caro och hans besättning inte bara bestämma den höga koncentrationen av cytokromoxidas III och 16S rRNA från mtDNA i både unga och gamla råttor , men de kunde också ta reda på ökningen av antalet mitokondriella sekvenser i nDNA när råttan blir äldre. Sålunda, baserat på dessa fynd, kan mitokondrier vara en viktig utlösare av åldrande, men det slutliga målet kan också vara kärnan.

Cancer

Den mest fruktansvärda effekten av NUMT-insättning händer när mtDNA:t sätts in i den reglerande regionen eller kärnstrukturgener och stör eller förändrar de vitala cellprocesserna. Till exempel, i primära låggradiga hjärnneoplasmer, hjälpte fluorescerande in situ hybridiseringsanalys med igenkännandet av mtDNA lokaliserat i kärnan i korrelation med en total ökning av mtDNA-innehållet i cellen. Denna ontogent tidiga händelse är viktig i etiologin för dessa tumörer. På liknande sätt är mtDNA-sekvenser närvarande i det nukleära genomet i hepatomceller i ett högre antal kopior i motsats till de normala vävnaderna . Ett annat exempel skulle vara HeLa nDNA som innehåller sekvenser som hybridiserar med mtDNA-fragment på ungefär 5 kb. En analys visade att nDNA från maligna celler innehåller sekvenser av mitokondriella cytokromoxidas I- , ND4- , ND4L- och 12S-rRNA-gener. Baserat på dessa fynd antogs mtDNA-fragment fungera som ett mobilt genetiskt element i initieringen av karcinogenes . Southern blotting är metoden som används för att bestämma frekvensen av mitokondriell insättning i nDNA av de normala och tumörcellerna från möss och råttor, vilket bevisade att mtDNA-sekvenserna är mycket fler och rikligare i nDNA från gnagartumörceller jämfört med normala celler . Med hjälp av FISH-sonder, PCR och datasekvensering, kartläggning och jämförelse fann Ju och hans lagkamrat att fusionerna mellan mitokondrierna och kärngenomet sker med en liknande hastighet per baspar av DNA som interkromosomala nukleära omarrangemang, vilket indikerar närvaron av en hög kontaktfrekvens mellan mitokondrie- och nukleärt DNA i vissa somatiska celler. Ju och hans lagkamrater undersökte också tidpunkten för somatisk mtDNA-integration i kärngenomet genom att bedöma fall där ett metastaserande prov hade sekvenserats utöver den primära tumören. I vissa fall är mtDNA-överföringar till kärnan i somatiska celler mycket frekventa och kan inträffa efter neoplastisk bildning och under loppet av subklonal utveckling av cancer, vilket tyder på att denna händelse inträffar i vanliga förfäders cancerkloner eller i normala somatiska celler före neoplastisk förändring. Dessa fynd visade att förekomsten av direkt korrelation mellan NUMT och cancer i olika kroppsorgan. Att förstå sambandet, tidpunkten för NUMT-insättningen, placeringen av insättningen och störda gener skulle hjälpa till att producera mer kraftfull och effektiv medicin.

Experimentell användning och fel

Även om förståelsen av icke-slumpmässig infogning av NUMT och att utföra viss funktion efter insättningen, hjälper till att avslöja strukturen och bestämma genomets fullständiga funktion, särskilt det mänskliga genomet, har NUMTs använts som experimentella verktyg och har varit fördelaktiga inom olika biologiska områden även innan du har någon kunskap om NUMTs funktion. Till exempel kan NUMTs användas inte bara som genetiska markörer utan också som ett verktyg för att förstå den relativa mutationshastigheten i kärnan och mitokondrierna samt att återskapa evolutionära träd. Den fortsatta processen för NUMT-integrering i kärngenomet bevisas av upptäckten av NUMT:er som har infogats i det mänskliga genomet efter divergensen mellan människa och schimpans. Vissa av dessa NUMTs är varierande med avseende på den genomiska närvaron eller frånvaron, vilket indikerar att de först nyligen har uppstått i den mänskliga populationen, vilket gör att de kan användas som genetiska markörer för härstamning. Genom att använda ett protokoll baserat på genomanpassning för att uppskatta antalet NUMT i närbesläktade arter, kunde Hazkani-Covo och Graur inte bara identifiera evolutionära händelser som kan ha påverkat NUMT-sammansättningen i varje genom, utan kunde också rekonstruera NUMT-sammansättningen i den gemensamma förfadern till människa och schimpans. NUMTs kan också användas för att jämföra hastigheten för icke-funktionell kärnsekvensutveckling med den för funktionell mtDNA och bestämma utvecklingshastigheten genom hastigheten för mutationsackumulering längs NUMT-sekvenser över tiden. De minst selektivt begränsade regionerna är segmenten med mest divergens från mitokondriella sekvensen. En av de mest lovande tillämpningarna av NUMT-studien är dess användning i studien av nukleär mutation. I metazoer anses NUMTs vara icke-funktionella. Därför kan nukleära mutationer särskiljas från mitokondriella förändringar och studiet av nukleotidsubstitution, -insertion och -deletion skulle vara möjligt. Dessutom tillåter homologin av paraloga NUMT-sekvenser med mtDNA:t testning för lokala sekvenseffekter på mutation. All denna information som erhållits från studien av NUMT-fragment kan användas för att förstå mitokondriell evolution såväl som evolutionära processer genom historien.

NUMT erbjuder en möjlighet att studera forntida mångfald av mitokondriella linjer och att upptäcka förhistorisk hybridisering mellan arter. Forntida hybridisering har först upptäckts (med hjälp av NUMTs) i borststjärtar, sedan i colobinapor och, senast, i en direkt mänsklig förfader. Hominidhybridiseringen hände vid tiden för separation av människa / schimpans / gorilla . Den senare studien rör en mänsklig NUMT som delas med schimpans och gorilla. Gemensam fylogeni av de tre NUMT-sekvenserna och mitokondriella genomen hos människoapor antyder att en gemensam förfader till de tre NUMT:erna har överförts till människa/schimpans/gorilla härstamning från en hominidart som separerats från dem genom cirka 4,5 miljoner år av mtDNA-evolution. Även om hybridisering av denna storlek inte är ovanlig bland primater, är dess förekomst i den direkta mänskliga härstamningen, runt den kritiska tiden för artbildning av människa/apa, ett häpnadsväckande resultat. Ytterligare NUMT med liknande fylogenier indikerar att sådana händelser kanske inte är unika.

Ett annat problem uppstod från närvaron av NUMT i genomet förknippat med svårigheten att fastställa det exakta antalet mitokondriella insättningar i nDNA. Att bestämma det exakta antalet NUMT-pseudogener för en art är en svår uppgift av flera skäl. En anledning som gör detektion av NUMT-sekvenser svårare är förändringen av dessa sekvenser genom mutation och deletion. Ytterligare två betydande hinder gör igenkänningen av NUMT mycket svårt; det första är bristen på korrelation mellan andelen icke-kodande nDNA och antalet NUMT-insättningar i kärngenomet. Det vill säga, NUMT-insättning kan ske i den kända eller förutspådda kodande regionen, både intron och exon, snarare än bara i intergenisk och intronisk region. För det andra är mitokondriellt DNA integrerat i djurkärngenom primärt begränsat till djur med cirkulära mitokondriella genom utan introner. NUMT-studier är inte tillgängliga på djur med linjära mitokondriella genom eller de med introninnehållande mitokondrier. Därför, trots alla tillgängliga avancerade teknologier, återstår det att fastställa om NUMT-transpositionsskillnader existerar mellan cirkulära och linjära mtDNA.

Användning av Sanger-sekvensering för att lokalisera NUMT-insättning i kärngenomet

Dessa svårigheter att upptäcka närvaron av NUMT kan vara problematiska. Translokerade mitokondriella sekvenser i kärngenomet har potential att amplifieras utöver, eller till och med istället för, den autentiska mtDNA-målsekvensen som allvarligt kan förväxla populationsgenetiska och fylogenetiska analyser eftersom mtDNA har använts i stor utsträckning för populationskartläggning, evolutionära och fylogena studier , artidentifiering med DNA-streckkod, diagnos av olika patologier och rättsmedicin. Denna samtidiga amplifiering av NUMT med fritt extrakromosomalt mtDNA förhindrar dessutom en från att bestämma det exakta antalet NUMT-fragment i genomet av olika organismer, såsom Aedes aegypti -myggor, särskilt de där förlängd translokation av mtDNA-fragment förekommer. Detta gör diagnosen av vissa mitokondriella störningar utmanande. Till exempel hittades en stor NUMT-pseudogen på kromosom 1, medan nyare analys av samma sekvens ledde till slutsatsen att sperma mtDNA har mutationer som orsakar låg spermierörlighet. Ett annat exempel skulle vara den senaste rapporten som beskriver en heteroplasmatisk mtDNA-molekyl innehållande fem länkade missense-mutationer spridda över de sammanhängande mtDNA- CO1- och CO2 -generna hos patienter med Alzheimers sjukdom , men de nyare studierna med PCR, restriktionsendonukleasplatsvarianter och fylogenisk analys föreslog. att de nukleära CO1- och CO2-sekvenserna avslöjade att de avvek från moderna mänskliga mtDNAs tidigt i hominid-evolutionen cirka 770 000 år tidigare och dessa bevarade NUMTs kunde orsaka Alzheimers sjukdom. Ett av de möjliga sätten att förhindra sådana felaktiga resultat är en amplifiering och jämförelse av heterogen sekvens, som omfattar både mtDNA och nDNA, med de erhållna resultaten från Sanger-sekvensering av renat och berikat mtDNA som visas i figur 4. Även om denna metod är enkel och endast ett fåtal primers krävs, det kommer att förhindra ett väsentligt fel i fylogenetiska studier av en population och alla tidigare nämnda falska resultat.

Se även