Isolering (mikrobiologi)

Inom mikrobiologi syftar termen isolering på separationen av en stam från en naturlig, blandad population av levande mikrober , som finns i miljön, till exempel i vatten eller jord , eller från levande varelser med hudflora , oral flora eller tarmflora , för att identifiera mikroberna av intresse. Historiskt sett laboratorieteknikerna för isolering först inom området bakteriologi och parasitologi (under 1800-talet), före de inom virologi under 1900-talet.

Historia

Laboratorieteknikerna för att isolera mikrober utvecklades först under 1800-talet inom området bakteriologi och parasitologi med hjälp av ljusmikroskopi . Lämpliga isoleringstekniker för virologi fanns inte före 1900-talet. Metoderna för mikrobiell isolering har drastiskt förändrats under de senaste 50 åren, ur ett arbetsperspektiv med ökande mekanisering, och med hänsyn till de involverade teknologierna, och därmed hastighet och noggrannhet.

Allmänna tekniker

För att isolera en mikrob från en naturlig, blandad population av levande mikrober , som finns i miljön, till exempel i vatten- eller markflora , eller från levande varelser med hudflora , munflora eller tarmflora , måste man separera den från mixen.

Traditionellt har mikrober odlats för att identifiera mikroberna av intresse baserat på dess tillväxtegenskaper. Beroende på den förväntade densiteten och livsdugligheten hos mikrober som finns i ett vätskeprov kan fysikaliska metoder för att öka gradienten som till exempel serieutspädning eller centrifugering väljas. För att isolera organismer i material med högt mikrobiellt innehåll, såsom avloppsvatten, jord eller avföring, kommer serieutspädningar att öka chansen att separera en blandning.

I ett flytande medium med få eller inga förväntade organismer, från ett område som normalt är sterilt (såsom CSF , blod inuti cirkulationssystemet) centrifugering, dekantering av supernatanten och användning av endast sediment kommer att öka chansen att växa och isolera bakterier eller vanligtvis cellassocierade virus.

Om man förväntar sig eller letar efter en särskilt kräsen organism, måste den mikrobiologiska kulturen och isoleringsteknikerna inriktas på den mikroben. Till exempel kan en bakterie som dör när den exponeras för luft endast isoleras om provet bärs och bearbetas under luftlösa eller anaeroba förhållanden. En bakterie som dör när den utsätts för rumstemperatur (termofil) kräver en förvärmd transportbehållare, och en mikrob som torkar och dör när den bärs på en bomullspinne kommer att behöva ett viralt transportmedium innan den kan odlas framgångsrikt.

Bakterie- och svampkultur

Ympning

Laboratorietekniker inokulerar provet på vissa fasta agarplattor med streakplatemetoden eller i flytande odlingsmedium , beroende på vad syftet med isoleringen är:

• Om man bara vill isolera en viss grupp av bakterier, såsom Streptococcus grupp A från en svalgpinne, kan man använda ett selektivt medium som kommer att undertrycka tillväxten av samtidiga bakterier som förväntas i blandningen (genom antibiotika som finns i agaren), så att endast streptokocker är "utvalda", dvs synbart sticker ut. För att isolera svampar Sabouraud-agar användas. Alternativt gynnar dödliga förhållanden för streptokocker och gramnegativa bakterier som höga saltkoncentrationer i mannitolsaltagar överlevnaden av alla stafylokocker som finns i ett prov av tarmbakterier, och fenolrött i agarn fungerar som en ph-indikator som visar om bakterierna kan fermentera mannitol genom att utsöndra syra i mediet. I andra agarer tillsätts ämnen för att utnyttja en organisms förmåga att producera ett synligt pigment (t.ex. granadamedium för Streptococcus grupp B ) som ändrar bakteriekolonins färg, eller för att lösa upp blodagar genom hemolys så att de lättare kan upptäckas. Vissa bakterier som legionellaarter kräver speciella näringsämnen eller toxinbindning som i träkol för att växa och därför måste medier som buffrad koljästextraktagar användas.
• Om man vill isolera så många eller alla stammar som möjligt, behöver olika näringsmedier samt berikade medier, såsom blodagar och chokladagar och anaeroba odlingsmedier såsom tioglykolatbuljong inokuleras. För att räkna upp tillväxten kan bakterier suspenderas i smält agar innan den blir fast, och sedan hällas i petriskålar , den så kallade 'hällplattmetoden' som används inom miljömikrobiologi och livsmedelsmikrobiologi (t.ex. mejeritestning) för att fastställa så kallad 'aerobic plate count'.

Inkubation

Efter att provet har inokulerats i eller på det valda mediet, inkuberas de under lämpliga atmosfäriska inställningar, såsom aeroba, anaeroba eller mikroaerobiska förhållanden eller med tillsatt koldioxid (5 %), vid olika temperaturinställningar, till exempel 37 °C i en inkubator eller i ett kylskåp för kall berikning, under lämpligt ljus, till exempel strikt utan ljus insvept i papper eller i en mörk flaska för skotokromogena mykobakterier, och under olika lång tid, eftersom olika bakterier växer med olika hastighet, varierande från timmar ( Escherichia coli ) till veckor (t.ex. mykobakterier) .

Med regelbundna serieintervaller inspekterar laboratorietekniker och mikrobiologer media för tecken på synlig tillväxt och registrerar det. Inspektionen måste återigen ske under förhållanden som gynnar isolatet överlevnad, dvs i en 'anaerob kammare' för till exempel anaeroba bakterier, och under förhållanden som inte hotar den som tittar på plattorna från att bli infekterad av en särskilt smittsam mikrob, dvs. ett biologiskt säkerhetsskåp för Yersinia pestis (pest) eller Bacillus anthracis (mjältbrand) till exempel.

Identifiering

När bakterier synbart har vuxit är de ofta fortfarande blandade. Identifieringen av en mikrob beror på isoleringen av en enskild koloni , eftersom biokemisk testning av en mikrob för att fastställa dess olika fysiologiska egenskaper beror på en renodling . För att göra en subkultur arbetar man återigen med aseptisk teknik inom mikrobiologi , lyfter en enskild koloni från agarytan med en ögla och stryker materialet i 4 kvadranter av en agarplatta eller överallt om kolonin var singulär och inte såg blandad ut. .

Gramfärgning av råprovet före inkubation eller färgning av nyodlat kolonimaterial hjälper till att avgöra om en koloni består av likformigt uppträdande bakterier eller är blandad, och bakteriernas färg och form tillåter en första klassificering baserad på morfologi. Inom klinisk mikrobiologi används många andra färgningstekniker för speciella organismer (sursnabb bakteriell färgning för mykobakterier). Immunologiska färgningstekniker, såsom direkt immunfluorescens, har utvecklats för medicinskt viktiga patogener som är långsamt växande ( Auramine-rhodamine-färgning för mykobakterier ) eller svåra att odla (som Legionella pneumophila- arter) och där testresultatet skulle förändra standardhantering och empirisk terapi .

Biokemisk testning av bakterier involverar en uppsättning agarer i flaskor för att separera rörliga från icke-rörliga bakterier . 1970 utvecklades en miniatyriserad version, kallad analytical profile index .

Framgångsrik identifiering via t.ex. genomsekvensering och genomik beror på rena kulturer.

Bakterier, kulturoberoende

Medan den snabbaste metoden för att identifiera bakterier är genom att sekvensera deras 16S rRNA- gen, som har PCR-amplifierats i förväg, kräver denna metod inte isolering. Eftersom de flesta bakterier inte kan odlas med konventionella metoder (särskilt miljö- eller jordbakterier) används metagenomik eller metatranskriptomik , hagelgevärssekvensering eller PCR-riktad sekvensering av genomet . Sekvensering med masspektrometri som i matrisassisterad laserdesorption/jonisering (MALDI-TOF MS) används vid analys av kliniska prover för att leta efter patogener. Helgenomsekvensering är ett alternativ för en singulär organism som inte kan karakteriseras tillräckligt för identifiering. Små DNA-mikroarrayer kan också användas för identifiering.

• Bensons mikrobiologiska applikationsmanual 8:e upplagan