Subkultur (biologi)
Inom biologi är en subkultur antingen en ny cellkultur eller en mikrobiologisk kultur som görs genom att överföra några eller alla celler från en tidigare kultur till färskt odlingsmedium . Denna åtgärd kallas subkultur eller passage av cellerna. Subkultur används för att förlänga livslängden och/eller öka antalet celler eller mikroorganismer i kulturen.
Roll
Cellinjer och mikroorganismer kan inte hållas i odling på obestämd tid på grund av den gradvisa ökningen av giftiga metaboliter , användning av näringsämnen och ökning av cellantal på grund av tillväxt. När näringsämnen är uttömda och nivåerna av toxiska biprodukter ökar, går bakterierna i övernattkulturen in i den stationära fasen , där spridningen avsevärt minskar eller upphör (platåerna för celldensitetsvärde). När mikroorganismer från denna övernattningskultur överförs till färska medier, utlöser näringsämnen tillväxten av mikroorganismen och den går igenom eftersläpningsfasen, en period av långsam tillväxt och anpassning till den nya miljön, och sedan logfasen, en period där celler växer exponentiellt.
Subkultur används därför för att producera en ny kultur med en lägre täthet av celler än ursprungskulturen, färska näringsämnen och inga giftiga metaboliter som tillåter fortsatt tillväxt av cellerna utan risk för celldöd. Subkultur är viktig för både prolifererande (t.ex. en mikroorganism som E. coli ) och icke-prolifererande (t.ex. terminalt differentierade vita blodkroppar ) celler. Subkultur kan också användas för beräkningar av tillväxtkurvor (ex. generationstid) och erhållande av log-fas mikroorganismer för experiment (ex. bakteriell transformation).
Typiskt är subkultur från en odling av en viss volym till färskt odlingsmedium med lika volym, vilket möjliggör långvarigt underhåll av cellinjen. Subkultur till en större volym odlingsmedium används när man vill öka antalet celler för till exempel användning i en industriell process eller vetenskapligt experiment.
Passagenummer
Det är ofta viktigt att registrera det ungefärliga antalet delningar celler har haft i kultur genom att registrera antalet passager eller subkulturer. När det gäller växtvävnadsceller kan somaklonal variation uppstå under långa perioder i odling. På liknande sätt i däggdjurscellinjer har kromosomavvikelser en tendens att öka med tiden . För mikroorganismer finns en tendens att anpassa sig till odlingsförhållanden, vilket sällan är exakt som mikroorganismens naturliga miljö, vilket kan förändra deras biologi.
Protokoll för passage
Protokollet för subodling av celler beror starkt på egenskaperna hos de involverade cellerna.
Icke-vidhäftande celler
Många celltyper, i synnerhet många mikroorganismer, växer i lösning och inte fästa vid en yta. Dessa celltyper kan subodlas genom att helt enkelt ta en liten volym av moderkulturen och späda den i färskt odlingsmedium. Celltäthet i dessa kulturer mäts normalt i celler per milliliter för stora eukaryota celler, eller som optisk densitet för 600 nm ljus för mindre celler som bakterier. Cellerna kommer ofta att ha ett föredraget intervall av densiteter för optimal tillväxt och subkultur kommer normalt att försöka hålla cellerna inom detta intervall.
Vidhäftande celler
Vidhäftande celler, till exempel många däggdjurscellinjer, växer fästa till en yta såsom botten av odlingskolven. Dessa celltyper måste lossas från ytan innan de kan subodlas. För vidhäftande celler mäts celldensiteten normalt i termer av konfluens , procentandelen av tillväxtytan som täcks av celler. Cellerna kommer ofta att ha ett föredraget intervall av konfluenser för optimal tillväxt, till exempel en däggdjurscellinje som HeLa eller Raw 264.7 föredrar i allmänhet sammanflytningar över 10 % men under 100 %, och subkultur kommer normalt att försöka hålla cellerna inom detta intervall. För subkultur kan celler lösgöras med en av flera metoder inklusive trypsinbehandling för att bryta ner proteinerna som ansvarar för ytvidhäftning, kelatering av kalciumjoner med EDTA som stör vissa proteinvidhäftningsmekanismer, eller mekaniska metoder som upprepad tvättning eller användning av en cellskrapa. De lösgjorda cellerna återsuspenderas sedan i färskt tillväxtmedium och får sätta sig tillbaka på sin tillväxtyta.