In-gel matsmältning

Steget för nedbrytning i gel är en del av provberedningen för masspektrometrisk identifiering av proteiner under proteomisk analys . Metoden introducerades 1992 av Rosenfeld. Otaliga ändringar och förbättringar av de grundläggande delarna av proceduren återstår.

I-gel-nedbrytningssteget innefattar primärt de fyra stegen; avfärgning, reduktion och alkylering (R&A) av cysteinerna i proteinet, proteolytisk klyvning av proteinet och extraktion av de genererade peptiderna .

Avfärgning

Proteiner som separerades med 1D eller 2D PAGE visualiseras vanligtvis genom färgning med färgämnen som Coomassie brilliant blue (CBB) eller silver . Även om metodens känslighet är betydligt lägre är användningen av Coomassie vanligare för prover avsedda för masspektrometri eftersom silverfärgningen försämrar analysen. Efter excision av proteinbandet av intresse från gelén kräver de flesta protokoll en avfärgning av proteinerna innan man fortsätter.

Avfärgningslösningen för CBB innehåller vanligtvis buffertsaltet ammoniumbikarbonat ( NH ₄ HCO ₃ ) och en fraktion av 30 %-50 % organiskt lösningsmedel (främst acetonitril ) . De hydrofoba interaktionerna mellan protein och CBB reduceras av den organiska fraktionen av lösningen. Samtidigt minskar den joniska delen av lösningen de elektrostatiska bindningarna mellan färgämnet och de positivt laddade aminosyrorna i proteinet. I motsats till en blandning av vatten med organiskt lösningsmedel ökar effektiviteten av avfärgning. En ökning av temperaturen främjar avfärgningsprocessen. Till en viss grad (< 10%) åtföljs avfärgningsproceduren med en förlust av protein. Vidare påverkar inte avlägsnandet av CBB utbytet av peptider i den masspektrometriska mätningen.

I fallet med silverfärgade proteinband åstadkoms avfärgningen genom oxidation av det metalliska silvret fäst till proteinet med kaliumferricyanid eller väteperoxid (H ₂ O ₂ ). De frigjorda silverjonerna komplexbinds därefter med natriumtiosulfat .

Reduktion och alkylering (R & A)

Färgning och avfärgning av geler följs ofta av reduktion och alkylering (r&a) av cystinerna eller cysteinerna i proteinerna. Härigenom bryts proteinernas disulfidbindningar irreversibelt upp och den optimala utveckningen av den tertiära strukturen erhålls. Reduktionen till tiolen åstadkommes genom reaktion med kemikalier som innehåller sulfhydryl- eller fosfingrupper såsom ditiotreitol (DTT) eller tris-2-karboxietylfosfinhydroklorid (TCEP). Under den efterföljande irreversibla alkyleringen av SH-grupperna med jodacetamid omvandlas cysteinerna till det stabila S-karboxiamidometylcysteinet (CAM; addukt: -CH2 _- CONH2 ₎ . Molekylvikten för cysteinaminosyraresten ökas därigenom från 103,01 Da till 160,03 Da.

Reduktion och alkylering av cysteinrester förbättrar peptidutbytet och sekvenstäckningen och identifieringen av proteiner med ett stort antal disulfidbindningar. På grund av sällsyntheten av aminosyran cystein för de flesta av proteinerna påverkar steget r&a inte någon förbättring av den masspektrometriska analysen. För den kvantitativa och homogena alkyleringen av cysteiner är positionen för modifieringssteget i provberedningsprocessen avgörande. Med denaturerande elektrofores rekommenderas det starkt att utföra reaktionen innan elektroforesen utförs, eftersom det finns fria akrylamidmonomerer i gelén som kan modifiera cysteinrester irreversibelt. De resulterande akrylamidaddukterna har en molekylvikt av 174,05 Da .

In-gel matsmältning

Efteråt utförs metoden med samma namn, smältningen av proteinerna i gel. Genom detta förfarande skärs proteinet enzymatiskt till ett begränsat antal kortare fragment. Dessa fragment kallas peptider och möjliggör identifiering av proteinet med deras karakteristiska massa och mönster. Serinproteaset trypsin är det vanligaste enzymet som används i proteinanalys . Trypsin skär peptidbindningen specifikt vid karboxyländen av de grundläggande aminosyrorna arginin och lysin . Om det finns en sur aminosyra som asparaginsyra eller glutaminsyra i direkt närhet till skärstället, minskar hydrolyshastigheten, en prolin C-terminal till skärstället hämmar hydrolysen fullständigt.

En oönskad bieffekt av användningen av proteolytiska enzymer är proteasets självnedbrytning. För att undvika detta tillsattes tidigare Ca ²⁺ -joner till rötningsbufferten. Nuförtiden erbjuder de flesta leverantörer modifierat trypsin där selektiv metylering av lysinerna begränsar den autolytiska aktiviteten till skärställena för arginin. Omodifierat trypsin har sin högsta aktivitet mellan 35 °C och 45 °C. Efter modifieringen ändras den optimala temperaturen till intervallet 50 °C till 55 °C. Andra enzymer som används för nedbrytning i gel är endoproteaserna Lys -C, Glu-C, Asp-N och Lys-N . Dessa proteaser skär specifikt vid endast en aminosyra, t.ex. Asp-N skär n-terminalen av asparaginsyra. Därför erhålls ett lägre antal längre peptider.

Analysen av den fullständiga primära sekvensen av ett protein med användning av endast ett proteas är vanligtvis inte möjlig. I dessa fall rekommenderas nedbrytning av målproteinet i flera metoder med olika enzymer. De resulterande överlappande peptiderna tillåter sammansättningen av den fullständiga sekvensen av proteinet.

För matsmältningen måste proteinerna fixerade i gelens matris göras tillgängliga för proteaset. Genomträngningen av enzymet till gelén tros underlättas av uttorkningen av gelbitarna genom behandling med acetonitril och efterföljande svallning i digestionsbufferten innehållande proteaset. Denna procedur bygger på antagandet att proteaset tränger in i gelén genom svullnadsprocessen. Olika studier om enzymernas penetration till gelén visade att processen nästan helt drivs av diffusion. Torkningen av gelén verkar inte stödja processen. Därför måste förbättringen av in-gel-digestionen uppnås genom att reducera enzymets väg till dess substrat, t.ex. genom att skära gelén i bitar så små som möjligt.

Vanligtvis körs in-gel-nedbrytningen som en process över natten. För användning av trypsin som proteas och en temperatur på 37 °C är inkubationstiden som finns i de flesta protokoll 12-15 timmar. Experiment om matsmältningsprocessens varaktighet visade dock att det efter 3 timmar finns tillräckligt med material för framgångsrik masspektrometrisk analys. Dessutom möjliggör optimeringen av betingelserna för proteaset i temperatur och pH fullbordandet av nedbrytningen av ett prov på 30 minuter.

Ytaktiva medel (rengöringsmedel) kan hjälpa till med solubilisering och denaturering av proteiner i gelén och därigenom förkorta nedbrytningstiderna och öka proteinklyvningen och antalet och mängden extraherade peptider, speciellt för lipofila proteiner såsom membranproteiner . Klyvbara tvättmedel är tvättmedel som spjälkas efter matsmältning, ofta under sura förhållanden. Detta gör tillsatsen av tvättmedel kompatibel med masspektrometri.

Extraktion

Efter avslutad nedbrytning måste peptiderna som genereras i denna process extraheras från gelmatrisen. Detta åstadkommes genom ett eller flera extraktionssteg . Gelpartiklarna inkuberas med en extraktionslösning och supernatanten samlas upp. I den första extraktionen återvinns nästan all peptid, upprepningen av extraktionssteget kan öka utbytet av hela processen med endast 5-10%. För att möta kraven på peptider med olika fysikaliska och kemiska egenskaper utförs en iterativ extraktion med basiska eller sura lösningar. För extraktion av sura peptider används en lösning som liknar koncentrationen och sammansättningen av uppslutningsbufferten; basiska peptider extraheras i beroende av den avsedda masspektrometriska metoden med en lågkoncentrerad sur lösning av myrsyra för ESI respektive trifluorättiksyra för MALDI . Studier på modellproteiner visade en återvinning av cirka 70–80 % av det förväntade peptidutbytet genom extraktion från gelén. Många protokoll innehåller en extra fraktion av acetonitril till extraktionslösningen som, i koncentrationer över 30 % (v/v), är effektiv för att minska adsorptionen av peptider till ytan av reaktionsrör och pipettspetsar . Vätskan från de sammanslagna extrakten indunstas i en centrifugalindunstare . Om det flyktiga saltet ammoniumbikarbonat användes för grundextraktionen, avlägsnas det delvis i torkningsprocessen. De torkade peptiderna kan förvaras vid -20 °C i minst sex månader.

Kritiska överväganden och faktiska trender

Några stora nackdelar med de vanliga protokollen för nedbrytning i gel är den långa tiden som behövs och de flera bearbetningsstegen, vilket gör metoden felbenägen med avseende på föroreningar (särskilt keratin ). Dessa nackdelar avlägsnades till stor del genom utvecklingen av optimerade protokoll och specialiserade reaktionsrör.

Mer allvarliga än svårigheterna med hanteringen är materialförluster vid bearbetning av proverna. Den masspektrometriska proteinanalysen utförs ofta vid detektionsgränsen, så även små förluster kan diktera framgång eller misslyckande för hela analysen. Dessa förluster beror på tvättning under olika bearbetningssteg, adsorption till ytan av reaktionsrör och pipettspetsar , ofullständig extraktion av peptider från gelén och/eller dålig jonisering av enstaka peptider i masspektrometern . Beroende på peptidernas fysikalisk-kemiska egenskaper kan förlusterna variera mellan 15 och 50 %. På grund av den inneboende heterogeniteten hos peptiderna har man hittills inte hittat en universellt giltig lösning för denna stora nackdel med metoden.

Kommersiella implementeringar

De kommersiella implementeringarna av in-gel digestion måste delas in i produkter för hög- och lågkapacitetslaboratorier.

Hög genomströmning

På grund av det mycket tidskrävande och arbetsintensiva standardförfarandet var metoden för ingel-nedbrytning begränsad till ett relativt litet antal proteinfläckar som skulle bearbetas åt gången. Därför har det visat sig vara det idealiska objektet för automationsambitioner att övervinna dessa begränsningar för industri- och servicelaboratorier. Idag, i laboratorier där in-gel digestion utförs i hög genomströmning kvantiteter, är proceduren vanligtvis automatiserad. Graden av automatisering varierar från enkla pipetteringsrobotar till mycket sofistikerade allt-i-ett-lösningar, som erbjuder ett automatiserat arbetsflöde från gel till masspektrometri. Systemen består vanligtvis av en punktplockare, en rötningsrobot och en spotter.

Fördelarna med automatiseringen förutom det större antalet spots som ska bearbetas åt gången är det minskade manuella arbetet och den förbättrade standardiseringen . På grund av metodens många hanteringssteg kan resultatet av den manuella processen variera beroende på användarens skicklighet och risken för kontaminering är hög. Därför beskrivs kvaliteten på resultaten vara en av de främsta fördelarna med den automatiserade processen.

Nackdelar med automatiserade lösningar är kostnaderna för robotar, underhåll och förbrukningsmaterial samt den komplicerade uppställningen av processen. Eftersom den automatiska plockningen behöver digitaliserad information om platsplatsen, måste analysen av gelbilden för relevanta fläckar göras med programvara som kräver standardiserade avbildningsmetoder och speciella skannrar. Denna långa procedur förhindrar forskaren från spontan identifiering av några intressanta fläckar från en enda gel samt behovet av att driva systemen med full kapacitet. Den resulterande mängden data från den efterföljande automatiserade MS-analysen är ett annat problem med system med hög genomströmning eftersom deras kvalitet ofta är tveksam och utvärderingen av dessa data tar betydligt längre tid än insamlingen.

Låg genomströmning

De nämnda nackdelarna begränsar den rimliga användningen av automatiserade in-gel matsmältningssystem till rutinlaboratoriet, medan forskningslaboratoriet med krav på flexibel användning av instrumenten för proteinidentifiering oftare stannar vid de manuella metoderna med låg genomströmning för in- gel digestion och MS-analys. Denna grupp av kunder är måltavla av industrin med flera kit-system för in-gel digestion.

De flesta av kitsystemen är bara samlingar av kemikalier och enzymer som behövs för in-gel-digestion medan det underliggande protokollet förblir oförändrat från den manuella standardproceduren som beskrivs ovan. Fördelen med dessa produkter för den oerfarna kunden ligger i den garanterade funktionen hos de olika lösningarna i kombination med ett färdigt protokoll för processen.

Ett fåtal företag har försökt att förbättra hanteringsprocessen av in-gel digestion för att även med manuell provberedning möjliggöra ett enklare och mer standardiserat arbetsflöde. Montage In-Gel Digest Kit från Millipore är baserat på standardprotokollet, men möjliggör bearbetning av ett stort antal parallella prover genom att överföra hanteringen av gelbitarna till en modifierad mikroplatta med 96 brunnar. Lösningarna för de olika stegen av ingel-nedbrytning pipetteras in i brunnarna på denna platta, medan avlägsnandet av vätskor utförs genom botten av brunnarna med en vakuumpump . Detta system förenklar hanteringen av de multipla pipetteringsstegen genom att använda flerkanalspipetter och till och med pipetteringsrobotar. Vissa tillverkare av högkapacitetssystem har faktiskt antagit systemet för att fungera med sina robotar. Detta illustrerar orienteringen av denna kitlösning till laboratorier med ett större antal prover.

externa länkar

• Flashfilm som illustrerar den experimentella proceduren för den optimerade in-gel-digestionen som beskrivs i Granvogl et al.

Se även

• Zymografi , en icke-relaterad teknik inom molekylärbiologi som också involverar nedbrytning av proteiner i en elektroforetisk gel