Zymografi
Zymografi är en elektroforetisk teknik för detektion av hydrolytiska enzymer , baserad på enzymets substratrepertoar. Tre typer av zymografi används; i gel zymografi, in situ zymografi och in vivo zymografi Till exempel kommer gelatin inbäddat i en polyakrylamidgel att smältas av aktiva gelatinaser som rinner genom gelén. Efter Coomassie-färgning är nedbrytningsområden synliga som tydliga band mot en mörkt färgad bakgrund.
Modern användning av termen zymografi har anpassats för att definiera studien och katalogiseringen av fermenterade produkter, såsom öl eller vin, ofta av specifika bryggare eller vinmakare eller inom en identifierad kategori av jäsning, såsom med en viss stam av jäst eller arter av bakterier . Zymografi hänvisar också till en samling relaterade, fermenterade produkter, betraktade som en samling verk. Till exempel kan alla öl som produceras av ett visst bryggeri tillsammans kallas dess zymografi.
Se även Zymologi eller den tillämpade vetenskapen om zymografi. Zymologi relaterar till de biokemiska processerna vid jäsning, särskilt urvalet av jäsande jäst och bakterier i bryggning, vinframställning och andra jästa livsmedel. Till exempel innebär öltillverkning applicering av toppjäst (ale) eller underjäst (lager), för att producera den önskade sorten av öl. Syntesen av jästen kan påverka ölets smakprofil, dvs diacetyl (smak eller arom av smör, smörkola).
Gel zymografi
Prover prepareras i en standard, icke-reducerande laddningsbuffert för SDS-PAGE . Inget reduktionsmedel eller kokning behövs eftersom dessa skulle störa återveckning av enzymet. Ett lämpligt substrat (t.ex. gelatin eller kasein för proteasdetektion) är inbäddat i den upplösande gelén under framställning av akrylamidgelen . Efter elektrofores avlägsnas SDS från gelén (eller zymogrammet ) genom inkubation i obuffrad Triton X-100 , följt av inkubation i en lämplig uppslutningsbuffert, under en optimerad tidslängd vid 37 °C. Zymogrammet färgas därefter (vanligtvis med Amido Black eller Coomassie brilliant blue ), och matsmältningsområden uppträder som tydliga band mot en mörkt färgad bakgrund där substratet har brutits ned av enzymet.
Variationer på standardprotokollet
Standardprotokollet kan kräva modifieringar beroende på provenzym; till exempel D. melanogaster digestiva glykosidaser i allmänhet reducerande betingelser (dvs närvaron av 2-merkaptoetanol eller DTT ) och i viss utsträckning upphettning. I själva verket tenderar separationerna efter upphettning till 50°C att uppvisa en avsevärd ökning i bandupplösning, utan märkbar förlust av aktivitet.
Ett vanligt protokoll som användes tidigare för zymografi av α-amylasaktivitet var det så kallade stärkelsefilmsprotokollet från WW Doane. Här kördes en naturlig PAGE-gel för att separera proteinerna i ett homogenat. Därefter lades en tunn gel med stärkelse upplöst (eller mer korrekt, suspenderad) i den under en tidsperiod ovanpå den ursprungliga gelén. Stärkelsen färgades sedan med Lugols jod.
Gel zymografi används ofta för att detektera och analysera enzymer som produceras av mikroorganismer. Detta har lett till variationer på standardprotokollet, t.ex. blandad-substrat zymografi.
Omvänd zymografi sampolymeriserar både substratet och enzymet med akrylamiden och är användbar för att demonstrera enzyminhibitoraktivitet . Efter färgning visualiseras hämningsområden som mörka band mot en klar (eller lätt färgad) bakgrund.
I imprintteknik separeras enzymet genom nativ gelelektrofores och gelén läggs ovanpå en substratbehandlad agaros .
Zymografi kan också appliceras på andra typer av enzymer, inklusive xylanaser , lipaser och kitinaser.