Fluorescerande glukosbiosensor
Fluorescerande glukosbiosensorer är enheter som mäter koncentrationen av glukos hos diabetespatienter med hjälp av känsligt protein som förmedlar koncentrationen med hjälp av fluorescens , ett alternativ till amperometrisk känsla av glukos . På grund av förekomsten av diabetes är det den främsta drivkraften i konstruktionen av fluorescerande biosensorer. En ny utveckling har godkänts av FDA som tillåter ett nytt kontinuerligt glukosövervakningssystem kallat EverSense, som är en 90-dagars glukosmonitor som använder fluorescerande biosensorer.
Ansökan
Att hålla glukosnivåerna i schack är avgörande för att minimera uppkomsten av skador orsakade av diabetes. Som en konsekvens av detta, i samband med insulinadministrering, är det främsta kravet för diabetespatienter att regelbundet övervaka sina blodsockernivåer. De övervakningssystem som för närvarande används allmänt har nackdelen att antalet avläsningar är lägre än optimalt, på grund av att de är beroende av en droppe färskt blod. Vissa kontinuerliga glukosmätare är kommersiellt tillgängliga, men lider av den allvarliga nackdelen med en kort livslängd för sonden. Majoriteten av dessa fungerar amperometriskt. Som ett resultat finns det ett försök att skapa en sensor som förlitar sig på en annan mekanism, till exempel via extern infraröd spektroskopi eller via fluorescerande biosensorer.
användning av fluorescens, den första och vanligaste är en Fret- konkurrensanalys mellan glukos och en märkt glukospolymer för bindningsstället för Concanavalin A. Under årens lopp, med en kombination av rationell design och screeningmetoder, har många möjliga kombinationer av fluorescerande sensorer för glukos studerats med varierande grad av framgång: I de flesta tillvägagångssätt översätts glukoskoncentrationen till en förändring i fluorescens antingen genom att använda en Fret par eller genom att använda miljökänsliga (solvatokroma) färgämnen i en mängd olika kombinationer, har den fluorescerande lilla molekylen, proteinet eller kvantprickan använts i kombination med en glukosbindande del, antingen en boronsyrafunktionaliserad fluorofor eller ett protein, såsom glukosoxidas, konkanavalin A, glukos/galaktosbindande protein, glukosdehydrogenas och glukokinas. I allmänhet är förändringen som ses med Fret- konkurrensanalyser liten (se nedan).
Teori om fluorescens
Fluorescens är en egenskap som finns i vissa molekyler, kallade fluoroforer , där de avger en foton kort efter att ha absorberat en med högre energivåglängd.
För att vara mer specifik, för att en elektron i en molekyls yttre omloppsbana ska hoppa från en orbital i marktillstånd till en orbital i exciterad tillstånd, kräver den en bestämd mängd energi, som i fallet med kromoforer (molekyler som absorberar ljus), kan erhållas genom att absorbera en foton med en energi lika eller något högre. Detta tillstånd är kortlivat, och elektronen återvänder till marknära orbitalen och förlorar energin antingen som värme eller i fallet med fluoroforer genom att sända ut en foton, som på grund av förlusten av skillnaden mellan energin hos den absorberade fotonen och den excitationsenergi som krävs, kommer att ha en lägre energi än den absorberade fotonen, eller, uttryckt i termer av våglängd, kommer den emitterade fotonen att ha en längre våglängd. Skillnaden mellan de två våglängderna kallas Stokes' shift .
Denna egenskap kan hittas i kvantprickar , vissa lantanider och vissa organiska molekyler med delokaliserade elektroner .
Dessa exciterade molekyler har en ökning i dipolmomentum och kan i vissa fall genomgå en intern laddningsomställning. När de har en elektronbortdragande grupp och en elektrondonerande grupp i motsatta ändar av resonansstrukturen, har de en stor förskjutning i laddningsfördelning över molekylen, vilket gör att lösningsmedelsmolekylerna omorienteras till ett mindre energiskt arrangemang, kallat lösningsmedelsavslappning. Genom att göra så minskar energin i det exciterade tillståndet, och omfattningen av skillnaden i energi beror på polariteten hos lösningsmedlet som omger molekylen.
Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda solvatokroma färgämnen, som ändrar deras egenskaper (intensitet, halveringstid och excitations- och emissionsspektra), beroende på polariteten och laddningen i deras miljöer. Därför kallas de ibland löst för miljökänsliga färgämnen. Dessa kan placeras på specifika rester som antingen ändrar sitt rumsliga arrangemang på grund av en konformationsförändring inducerad av glukos eller finns i den glukosbindande fickan varigenom förskjutningen av vattnet som finns närvarande av glukos minskar polariteten.
En ytterligare egenskap hos fluorescens som har funnit en stor användning är Förster resonansenergiöverföring ( Fret ) där energin från den exciterade elektronen i en fluorofor, som kallas donatorn, förs vidare till ett närliggande acceptorfärgämne, antingen en mörksläckare ( icke-emitterande kromofor) eller annan fluorofor, som har ett excitationsspektrum som överlappar med donatorfärgämnets emissionsspektrum, vilket resulterar i en reducerad fluorescens.
För avkänningsändamål används denna egenskap i allmänhet antingen i kombination med en biomolekyl, såsom ett protein, som genomgår en konformationsförändring vid ligandbindning, ändrar avståndet mellan de två markörerna på detta protein, eller i en konkurrensanalys, där analyten måste konkurrera med en känd koncentration av en fixerad märkt ligand om det märkta bindningsstället för protein. Därför Fret mellan bindningsstället och den konkurrerande liganden när analytkoncentrationen ökas. I allmänhet är den konkurrerande liganden i fallet med glukos dextran , en lång glukospolymer fäst vid ställningen eller till enzymet.
Förster resonansenergiöverföring
Under årens lopp, med hjälp av en kombination av rationell design och screeningprocedurer, har många möjliga typologier av fluorescerande sensorer för glukos skapats med varierande grad av framgång. I allmänhet förlitar sig dessa sensorer antingen på Fret eller på känslighet för polaritetsförändringar för att översätta glukoskoncentrationen till fluorescerande intensitet.
Förutom fluoroforerna innehåller dessa sensorer en molekyl som ger glukosspecificitet, vanligtvis ett protein. En mängd olika proteiner har använts för detta ändamål, ofta med olika laboratorier som koncentrerar sig på ett visst protein.
Den första glukosbiosensorn som rapporterats i litteraturen tillverkades 1982 av Schultz grupp med användning av en Fret -konkurrensanalys mellan glukos och en märkt glukospolymer för bindningsstället för Concanavalin A infångat i en ihålig dialysfiber. Som ett resultat användes Con A flitigt i efterföljande sensorer i flera labb, men Con A lider av nackdelen med hög toxicitet och låg reversibilitet. Som ett resultat undersöktes och undersöks andra glukosbindande proteiner av flera laboratorier.
I Biotex Inc. (Houston) skapade McNichols och Ballastardt en dialysfiberomsluten ConA Fret- sensor, som har testats i djurmodeller i flera år.
Amperometriska biosensorer, däremot, kan endast använda glukosoxidas som ett protein, eftersom det är ett redoxenzym. Detta protein har också använts i fluorescerande avkänning antingen helt enkelt som ett apoenzym eller som ett holoenzym. Ett undantag från denna grupp av sensorer är Biocapacitor A Sodes grupp, som istället förlitar sig på glukosdehydrogenas.
Aktiviteten av glukosoxidas har också använts för att göra livstidsbaserade fluorescerande/fosforescerande sensorer, och dra fördel av det faktum att proteinet oxiderar glukos genom att använda molekylärt syre, och att syre släcker ruteniums fluorescens. Detta gjordes av Uwira och kollegor 1984 och följdes av flera grupper.
För att vara specifik har Endo och Pasic använt denna GOx-baserade syrgassläckningsanalys för att göra en fiberbaserad sensor, medan McShane använder en GOx-baserad syrgassläckningsanalys i mikrosfärer gjorda med syfte att subkutan injektion för att skapa vad som gruppen har myntat en "smart tatuering", en sensor som fungerar icke-invasivt genom att rapportera över huden och dra nytta av det faktum att huden är genomsläpplig för nära-infrarött ljus. Dessutom har den här gruppen skapat flera Fret- kompletterande analyser, först med ConA (TRITC-Con A /FITC-dextran (500kDa)), men sedan bytte till GOx-apoenzym 2004 (TRITC-apo-GOx /FITC-dextran (500kDa) ), och 2009 testade sensorer (QSY-21-apo-GOx /Alexa647-dextran) i mikrosfärer. Flera andra grupper har konstruerat smarta tatueringar och recenseras nedan.
En speciell GOx-syrerutenium-släckningsanalys användes i en studie i Ingo Klimants grupp, i en fullt fungerande sensor för att mäta glukosnivåer hos en frisk frivillig. Sensorn konstruerades genom att funktionalisera en syresensor med glukosoxidas och föra in den i den yttre delen av en kateter som används för övervakning.
Apoenzymer kan fortfarande binda glukos, men på grund av bristen på kofaktorer (in vitro) kan de inte katalysera deras reaktion, så det är mindre troligt att de skadas.
Andra proteiner som har använts är glukokinas från en termofil i D'auria-gruppen och glukos-galaktosbindande protein ( Ggbp ), som inte är ett enzym utan ett periplasmatiskt protein involverat i kemotaxi som genomgår en stor konformationsförändring.
Majoriteten av de fluoroforer som används för sensorerna är små molekyler, även om vissa sensorer har tillverkats med kvantprickar (QD) eller fluorescerande protein.
Sensorer har tillverkats med QD som Fret- donatorer och en liten molekyl eller guld nanopartikel (dark quencher) som acceptorer. Ett exempel på det förstnämnda är Loebs sensil, ett optiskt fibersystem där kvantpunkten är fäst vid ConA medan tetrametylrhodamin är fäst vid cyklodextran, som i sin tur är fäst vid PEG-diakrylatställningen. Ett exempel på det senare är Tang med QDs-ConA-beta-CDs-AuNPs.
Fluorescerande protein kan göras till ett fusionsprotein med ett önskat protein, vilket kringgår märkningsstegen. Shultz gjorde en Ggbp- molekyl med två GFP i varje ände. Det har inte rapporterats i litteraturen, men i teorin är det möjligt att förbättra detta genom att göra en riktad in vitro-evolution med hjälp av FACS. Detta är inte lätt att göra genom märkning, även om en screening har försökts av Pitner.
Fluorescens är inte den enda typen av luminescens som kan uppnås i biologiska system: Kemiluminescens, generering av ljus med hjälp av kemiska reaktioner, produceras av vissa proteiner, såsom Aqueorin från symbiont hos maneter och luciferas från symbiont hos eldflugor. Dessa har använts för att göra glukossensorer: Daunert tillverkar en Ggbp -delad aqueorinsensor och 2009 gjorde Koji Sode Ggbp -luciferas med Asp459Asn (Glc not Gal).
Förutom småmolekylära färgämnen har fluorescerande proteiner använts: En grupp gjorde en nära-infraröd (NIR) Fret -sensor detekterad med hjälp av tidsupplöst /nanotomografi allophycocyanin-ConA/malakitgrön-Dextran, avseende Fret med Allophycocyanin, som MacColl har recenserat.
Förutom protein som den glukosbindande delen har boronsyrafunktionaliserade molekyler använts. Boronsyra binder till vicinala grupper, företrädesvis hydroxyl; därför har den en hög affinitet för kolhydrater. Användningen av boronsyragruppen för igenkänning av sackarid har studerats brett av Shinkai, James och deras medarbetare. För att dra fördel av detta har flera tillvägagångssätt använts.
Ett tillvägagångssätt är genom Fret- släckning, där systemet kan arbeta genom moduleringen av släckningen av ett färgämne med en boronsyrafunktionaliserad viologen.
Ett alternativt tillvägagångssätt är genom fotoinducerad elektronöverföring (PET), en mekanism för fluorescenssläckning på grund av den elektronrika tertiära aminogruppen nära fluoroforen, som påverkas av förändringen i laddningen av den närliggande boronatgruppen när glukos binds . Detta har använts i kombination med livslängd av en grupp, inte bara i fluorescens utan som NMR-medel för avbildning med ett Europium (3+) boronsyrafärgämne.
Miljöavkännande färgämnen
Majoriteten av sensorerna som använder miljökänsliga färgämnen har använt Ggbp , ett transportprotein som binder till D-glukos och D-galaktos och transporterar dem till den membranbundna Trg-receptorn som utlöser bakteriens kemotaxi mot den glukoskällan. Det tillhör malG-familjen i Escherichia coli, som inkluderar det maltosbindande proteinet, som, beroende på närvaron av glukos, kan anta två distinkta konformationer eller möjligen tre som genererar en 31° gångjärnsrörelse mellan de två globulära domänerna sammankopplade med ett gångjärn. , vilket är den glukosbindande fickan. Dess affinitet för glukos är K=0,2 μM, vilket är mycket lägre än det patofysiologiska intervallet för glukos som finns vid diabetes (1,7-33 mM). Som en konsekvens har flera studier gjorts för att sänka affiniteten för Ggbp , vilket annars skulle resultera i nästan mättnad av Ggbp genom hela de patofysiologiska glukoskoncentrationerna. Bindningsaffiniteten för Ggbp ändras när den märks endosteriskt eller peristeriskt, så flera mutanter som arbetar i intervallet nära patofysiologisk glukos har skapats.
Ggbp innehåller fem tryptofanrester, varav två, W183 i bindningsstället och W284 i den N-terminala domänen (som kan binda kalcium), påverkar autofluorescensspektra vid glukosbindning.
Vissa studier med Ggbp och solvatokromiska färgämnen fungerar inte för att skapa en sensor, utan för att belysa kemin bakom konformationsförändringen av Ggbp . Exempel på detta inkluderar en studie som använder L255C med akrylodan och rutenium vid N-terminalen som avslöjar tre konformationstillstånd stängda och vridna, fluorescensen och fosforescensen av tryptofan W183 under normala förhållanden [52], under högt tryck och med eller utan kalcium.
Sode et al. gjorde en serie mutanter av Ggbp för att öka Kd i den omärkta formen nära fysiologiskt område (Phe16Ala) och ta bort galaktosspecificitet (Asp14Glu).
Svaret från ett miljökänsligt färgämne fäst till en specifik rest av Ggbp beror inte bara på märkningsplatsen, som har en viss miljö, utan också på färgämnets natur, som interagerar olika beroende på dess geometri. Interaktionen mellan ett givet färgämne och dess miljö är svår att förutsäga i silico. Som ett resultat, för att få en fungerande sensor, har flera oberoende studier screenat en uppsättning miljökänsliga färgämnen fästa vid flera möjliga platser i bindningsfickan (endosterisk plats), nära den (peristerisk plats) eller bort från den (allosterisk plats) ).
En fördel med Ggbp är att det i vildtypen inte finns några cysteinrester, vilket gör införandet av denna rest på en specifik plats idealisk för märkning.
Ett team under ledning av Homme Hellinga genomförde två storbildsskärmar. I den första (2002) gjorde de en serie (320 konstruktioner) av märkta mutanter av 11 bakteriellt periplasmatiskt bindande protein inklusive Ggbp för vilket de gjorde nio mutanter som introducerade ett cystein på en specifik plats (Y10C, N15C, E93C, E149C, H152C, W183C, L255C, D257C, V296C) och testade svaret när det var märkt med ett av åtta färgämnen (pyren (340, 390); akrylodan (390, 500); fluorescein (485, 520); NBD (490, 540); NBDE (490, 530), JPW4039 (485, 590), JPW4042 (470, 640) och JPW4045 (470, 640)). Av de 72 gjorda kombinationerna Ggbp märkt med akrylodan i position W183C en femfaldig förändring och kd=5mM.
I en efterföljande studie (2007), med hjälp av värmestabila Ggbp från Thermotoga maritima screenade de fem mutanter (Y13C, W14C, Y189C, S131C och M239C) med fyra färgämnen ( Ianbd , Acrylodan , Cy5 och Cy3) som identifierade Y513C-Cy. vilket gav en maximal ökning på 50 % och affinitet vid 15 mM.
En grupp ledd av Daunert använde tre endosteriska mutanter (G148C, H152C och M182C) i kombination med fyra färgämnen (akrylodan, 1,5- IAEDANS , MDCC och Ianbd -ester) som identifierade M182C-MDCC, vilket gav en 30% förändring i fluorescens. Ett helt annat tillvägagångssätt togs av Pitner i BD, som använde ett enda färgämne ( Ianbd ) fäst vid E149C som utgångspunkt för en riktad evolution screen, där ett mutantbibliotek skapas och väljs ut för "vinnare", nämligen mutanter som möter urvalskriterierna. Med detta tillvägagångssätt identifierade de E149C/A213R/L238S med kd på 10 mM och en åttafaldig ökning av fluorescens; denna mutant användes senare för SPR.
Oberoende av varandra testade en annan grupp (J Pickup) två mutanter (H152C och M182C) märkta med Badan (6-bromoacetyl-2-dimetylaminonaftalen), bundna till tiolgruppen i cisteinet som infördes vid plats 152 (H152C-mutant). Detta visade en trefaldig ökning (200 % förändring) vid mättande glukosbindning, vilket gör den till en idealisk kandidat för en sensor. Senare arbete, med att adoptera mutationerna identifierade av Pitner (ovan), genererade en Badan -märkt Ggbp- mutant (H152C/A213R/L238S), med en dissociationskonstant i det mänskliga fysiologiska glukosintervallet (Km=11mM) och en dubbel ökning av fluorescens ( 100 % förändring).
Vävnadsautofluorescens
Ett annat papper tyder på att den naturliga fluorescensen (autofluorescensen) i vävnader kan utnyttjas för att spåra glukoskoncentrationer. Dessa studier utnyttjade det faktum att NAD(P)H , i sin reducerade form, är autofluorescerande, och att metaboliter som glukos orsakar en förutsägbar ökning av NAD(P)H- reduktion.
Sensing in vivo
Ett alternativt sätt att mäta förändringen i miljön för miljöfärgämnen är deras förändring i livslängd, vilket kan ge bättre resultat i vissa sensorer, med hjälp av lantanider eller t.ex. det tidigare nämnda rutenium (Ru) metall-ligandkomplexet, antingen med GOx eller som en Fret - acceptor av ett miljökänsligt färgämne som i fallet med ANS26- Ggbp i en ruteniumbelagd kyvett som visar liten ökning i intensitet men en väsentlig förändring i livslängden.
Konstruktionen av det fluorescerande proteinet är bara ett delsystem av en kliniskt genomförbar övervakningsanordning: det avkännande proteinet måste immobiliseras och dess fluorescens måste avläsas av ett detekterande subsystem som i sin tur informerar användaren.
I den ideala situationen skulle detektorn kunna implanteras med det immobiliserade proteinet och frågas med radiofrekvens, men detta har för närvarande endast uppnåtts med amperormetriska sensorer. Det allmänna tillvägagångssättet för fluorescerande sensorer är att fästa proteinet till ena änden av en optisk fiber implanterad under huden medan den andra extremiteten är ansluten till detektionsundersystemet, som inkluderar en vägdelare (skivad fiber eller dikroisk spegel) för att tillåta fibern att överföra både excitationen och det emitterade ljuset, en filtrerad ljuskälla (i allmänhet en laser) och en filtrerad fotodetektor (en CCD eller en PMT). Den sålunda insamlade informationen analyseras sedan med en dator.
Smart tatuering
Huden är permeabel för nära-infrarött ljus (NIR). Som en konsekvens kan nära-infraröda färgämnen mätas över huden utan behov av en optisk fiber; detta har kallats en "smart tatuering" av McShane som skapade en nära-infraröd syrgassläckningsanalys som finns i mikrosfärer.
Det finns dock en begränsad mängd kommersiellt tillgängliga fluorescerande färgämnen och en begränsad mängd miljökänsliga färgämnen, såsom cyanin cy7. Som en konsekvens gjorde Pitner ett reaktivt Nile Red-färgämne, men hittills har ingen studie med en Nile Red- Ggbp -sensor utförts.
Ändå har flera studier med NIR-färgämnen gjorts. Pickup och Birch gjorde en NIR Fret- sensor som mätte både tidsupplösta räkningar eller genom nanotomografi av allofycocyanin-ConA/malakitgrön-Dextran, där allofycocyanin är ett NIR-fluorescerande protein. I en annan studie bedömdes autofluorescensen av NAPH, en energibärare i celler, som en indirekt indikator.
En grupp på BioTex Inc, ledd av McNichols och Ballerstadt, skapade en NIR Fret -sensor baserad på ConA, med NIR-färgämnen Alexa 647 och Alexa 750 (ursprungligen Alexa 647 & cy7) inneslutna i en dialysfiber fäst vid änden av en optisk fiber, som de har döpt till "FAS" (fluorescerande). För att förbättra stabiliteten fäste de proteinet till en sephadex, en makroporös hydrogel. Trots förändringen i Fret på endast 35 % över det patofysiologiska området (möjligen 40 % maximal förändring från ingen glukos till mättnad), har sensorn visat sig minska i funktionalitet med endast 20 % efter 450 dagars inkubation vid 37 °C (99 °C) F) och att övervaka glukos såväl som Medtronic/Minimed CGMS-sensorn i djurmodeller (mus, gris och hund); men deras uttalade mål är att skapa en smart tatuering.
Draper Laboratory utvecklar också en smart tatuering och testar för närvarande på djur. Funktionen och identiteten för sensorn har inte avslöjats.
Inkapsling i dialysmembran
Trots den högre fördelen med smarta tatueringar jämfört med en transdermal optisk fiber har ingen in vivo smart tatuering ännu påvisats, medan fiberbaserade system har visat sig vara potentiella sensorer.
Majoriteten av sensorerna som nämndes i de föregående avsnitten bestod av märkta proteiner i lösning. De enda sensorerna som har utvecklats mot en implanterbar sensor har varit antingen GOx-rutenium-syresläckande analyssensorer eller Fret -tävlingsanalyssensorer; Hittills har inga miljökänsliga färgämnesbaserade sensorer fästa i änden av en fiber publicerats.
För att fiberbaserade biosensorer ska fungera måste proteinet vara immobiliserat till fibern som antingen kan fångas i ett ihåligt rör av dialysmembran eller fångas i en hydrogel.
Ett ihåligt dialysrör är ett rör med en diameter på under millimeter vars väggar är sammansatta av porös tvärbunden cellulosa utformad för att släppa igenom små lösta ämnen men inte stora biomolekyler, såsom protein med en cut-off som sträcker sig från 0,5 till 20 kDa. Som en konsekvens är de väl lämpade för sensoriska tillämpningar, där analyten är fri att diffundera över medan proteiner inte kan, både sensorproteinet inuti och blod/interstitiell vävnadsproteaser. Faktum är att Menarini Diagnostics GlucoDay-sensor har en förbättrad livslängd eftersom den injicerade sonden använder ett dialysmembran, men för att drastiskt öka diffusionshastigheten är den kopplad med en pump.
Inkapsling i en hydrogel
När det gäller dess tillämpning vid fluorescerande avkänning av glukos, infångades den första glukosbiosensorn genom fluorescens, som, som nämnts, gjordes 1982 med hjälp av en Fret- konkurrensanalys för bindningsstället för ConA, i ett förseglat mikrodialysrör, i samma lab, nämligen av J Schultz, 2001 publicerades en annan studie med mikrodialysfibrer med användning av en Fret ConA-sensor men med andra etiketter och med användning av sephadex istället för dextran (den förra är flera storleksordningar större). Därefter började Dr Ballastardt BioTex som senior forskare under Dr Roger McNichols, chefsforskaren, där de under de senaste sju åren har testat den tidigare nämnda FAS-sensorn, som använde samma Fret-system i ett dialysrör. För att vara specifik laddades det märkta proteinet med en P10-spets i ett dialysrör 200 μm brett som hade förseglats med cyanoakrylat (superlim) i ena änden med eller utan en optisk fiberände insatt inuti.
Inom området sensorer för analyter har glukossensorer legat i framkant på grund av den stora mängden forskning om glukossensorer som ett resultat av prevalensen av diabetes, ändå en bred bredd av optiska fiberbaserade biosensorer, främst med hjälp av enzymer, immunanalyser, nukleinsyror, hela celler eller biomimetiska material och förlitar sig på olika detektionsmetoder (fluorescens, absorbans, kemiluminescens och spridning) och fästmetoder (beläggning, hydrogeler eller membran).
Majoriteten av dessa sensorer är dock beroende av att fånga proteinet i hydrogeler, eftersom dessa är mer robusta och skyddar proteinet mer än en enkel beläggning eller membran. En hydrogel är en porös tvärbunden polymermatris fylld med vatten. Flera typer av hydrogel finns och har använts för att fånga små molekyler såsom färgämnen, biomolekyler, såsom enzymer eller hela celler. När det gäller protein kan de fungera antingen genom att fysiskt fånga in proteinet med porer som är mindre än proteinerna eller genom kemisk koppling av proteinet till matrisen. I fysiskt infångande geler måste proteinet tillsättas när gelén är tvärbunden, så de använda förhållandena får inte skada proteinet, exklusive hydrogelen, som kräver icke-vattenhaltiga lösningsmedel eller starka kemikalier, ett exempel är TEMED-persulfatkatalyserad ( peroxidradikalinitiering) akrylamid eller akrylat, som används för SDS PAGE men inte för proteininkapsling.
Hydrogeler har studerats omfattande, huvudsakligen i infångningen av små molekyler för läkemedelstillförsel, inklusive fall där hydrogelnanopartiklarna långsamt släpper läkemedlet till en riktad plats. Hydrogeler kan klassificeras enligt deras polymerbeståndsdelar, som kan vara naturliga (Hyaluronan, alginsyra, pektin, karragenan, kondroitinsulfat, dextran och dextransulfat, kitosan, polylysin, kollagen, karboximetylkitin, fibrin, agaros, pullan), eller syntheticulan. ( PEG , PLA, PLGA, PCL, PHB, PVA , PNVP, P(HEMA), [ förtydligande behövs ] p(biskarboxi-fenoxi-fosfazen), p(GEMA-sulfat) och andra), eller en hybrid av de två . Förutom organiska hydrogeler finns sol-geler, som är syrebryggade silikater (eller titanoxid), som polymeriserar i vatten. En ytterligare klassificering kan vara genom polymerisationsmetod, som kan vara fysikalisk (frysning eller upphettning) eller kemisk (y-strålning, syre eller fotoinducerad radikalpolymerisation i fallet med akrylater, vinyler och akrylamider).
Alla de olika hydrogelerna har olika fördelar och nackdelar, såsom biokompatibilitet, proteinstabilitet, toxicitet eller livslängd; till exempel kan gelningsförhållandena för sol-geler skada proteinet, och som ett resultat kan flera sampolymerer, såsom kitosan, tillsättas (tillverkar hybridgeler) eller alternativa monomerer, såsom glykolmodifierad tetraetoxisilan eftersom det är mer biokompatibel än den vanligen använda metoxi- eller etoximodifierade tetraetoxisilanen.
Fibrer med hydrogel
När det gäller fiberoptikbaserade biosensorer har flera hydrogeler använts men främst akrylatbaserade polymerer och sol-geler, antingen genom kemisk eller fysisk inneslutning. När det gäller acetylkolinesteras, målet för många bekämpningsmedel, har en sensor gjorts som kemiskt länkar enzymet till en akrylathydrogel eller fysiskt fångar enzymet i solgel.
En optisk fiberbaserad hydrogel-infångad biosensor för glukos gjordes i labbet hos Loeb (Liao och kollegor) och fick namnet Sencil. denna sensor bestod av en fototvärbunden diakrylatmodifierad PEG-hydrogel innehållande tetra-rhodaminen (TRITC), märkt Fret -konkurrent betacyklodextrin och det kvantprickmärkta apoenzymet Concanavalin A. Denna sensor testades endast in vitro med avseende på funktionalitet; några tester gjordes dock för att se kompatibiliteten hos fibern som implanterats transdermalt i möss. Speciellt övervakades inflammationen och energin som krävdes för att avlägsna den med våld mättes, vilket bevisade att den kollagenbelagda fibern krävde mer kraft än att ta bort ett hårstrå som har samma diameter (200μl).
En annan fiberbaserad sensor gjordes i Singaram lab (santa Cruz). Detta använde en 2-hydroxietylmetakrylathydrogel som en byggnadsställning på vilken två färgämnen fästes, ett ett fluorescerande anjoniskt färgämne och en katjonisk släckare (för att vara specifik, en viologen) funktionaliserad med borsyra, som antar en negativ laddning när den binds till glukos, vilket gör molekylens nettoladdning är neutral och mindre attraherad av fluoroforen, och modulerar därför dess intensitet baserat på glukoskoncentrationen.
Majoriteten av hydrogelerna är fästa på fibern, ett undantag är den fiberoptikbaserade sensorn tillverkad av Itsubayashis grupp för att mäta glukos i fisk (hälsoindikator), som använde ett dialysmembran som stöd för hydrogelen. För att vara mer specifik förlitade den sig på en GOx-syre-rutenium-släckningsanalys där proteinet blandades med AWP (azidfunktionaliserad polyvinylalkohol, en fototvärbindningsbar polymer) och tvärbinds till ett dialysmembran som rullades runt en förtillverkad ruteniumsyresond (havoptik) och sätts in i en 18-gauge nål med åtta hål på sidan (liknar en brännare). I en sådan uppställning har proteinets integritet ingen effekt på sensorn, såvida inte under en viss koncentration. Som en konsekvens är förstörelsen eller otillgängligheten av en del av proteinet inte problematisk, vilket är i motsats till Fret eller miljökänslig avkänning. Men svarshastigheten för denna sensor är långsam och kräver en matematisk förutsägelse för att tillämpas på mätningen.
En alternativ användning av boronsyra i hydrogeler ses i Stokke i Norge där svällningen av en boronatfunktionaliserad akrylamidgel på grund av laddningsförändring vid glukosbindning mäts med en Fabry-Pérot interferometer på den andra änden av fibern (observera att detta är en annan metod än fluorescens och förlitar sig på spridning).
Ett undantag från användningen av att placera den optiska fibern transdermalt ses i den tidigare nämnda fibern från Ingo Klimants grupp (rutheniumsläckning av syre som frigörs av glukoskatalyserad GOx): Sensorn konstruerades i själva verket genom att funktionalisera en förtillverkad syrgassensor med glukosoxidas och för in den i en glukosavkännande apparat för amperometriska sensorer, i synnerhet en mikrodialyskateter CMA 60 implanterad transdermalt och sensorn ansluten till dess tygonslang. Denna sensor testades i en mänsklig volontär och visade resultat i nivå med nuvarande amperometriska system. Användningen av en fiber dikterades av förhandstillgängligheten av denna jämfört med en ruteniumbelagd lins, som skulle ha uppnått samma resultat, så detta tillvägagångssätt bör placeras i en kategori för sig tillsammans med transdermala fibrer och smarta tatueringar. Syftet med gruppen är dock att skapa glukoskänsliga nanopartiklar som ska förhöras med en transdermal optisk fiber och kontrolleras magnetiskt. Som en följd av detta förbättrar gruppen syreavkänningssonden genom att undersöka nya syrekänsliga fosforescerande material, nanopartikelformulering och skapandet av magnetiska nanopartiklar.
Se även
Anteckningar
- ^ Trots kontroversen kring Homme Hellinga (se Hellinga-kontroversen expanderar ) är dessa resultat inte under utredning.
- ^ Trots att samma mutant är närvarande, citerar inte tidningen utan erhöll mutanten genom att undersöka den sekundära strukturen.