Arginylering
Arginylering är en posttranslationell modifiering där proteiner modifieras genom tillsats av arginin (Arg) vid den N-terminala aminogruppen eller sidokedjorna av reaktiva aminosyror av enzymet arginyltransferas (ATE1) . Nyligen genomförda studier har också visat att hundratals proteiner in vivo är arginylerade, proteiner som är väsentliga för många biologiska vägar. Även om det fortfarande är dåligt förstått i en biologisk miljö, är ATE1-enzymet mycket konserverat, vilket tyder på att arginylering är en viktig biologisk posttranslationell modifiering.
Exempel på ATE1-mål som har identifierats inkluderar ornitindekarboxylas , tyroglobulin , insulin och neurotensin .
Upptäckt
1963 observerade en grupp forskare att specifika radioaktiva aminosyror införlivades i proteiner som erhållits från ribosomfria cell- och vävnadsextrakt. Denna inkorporering av aminosyror i celler som saknar ribosom observerades först i prokaryoter med användning av leucin (Leu) och fenylalanin (Phe) , och upptäcktes ytterligare i leverextrakt från däggdjur med arginin . Inkorporeringen av andra aminosyror i celler som saknar ribosomer gav inte liknande resultat, vilket tyder på att mekanismen var specifik för leucin och fenylalanin i bakterier och arginin hos däggdjur . En av de mest intressanta aspekterna av arginylering är att aminosyrorna som används för arginylering överförs från aminoacyl-tRNA till målproteinet, utan användning av några andra translationskomponenter. Detta sätt att modifiera proteiner post-translationellt förekommer inte i någon annan aminosyratillsats till proteiner, såsom vid glycylering, glutamylering och tyrosinering, vilket gör arginylering helt unik.
Efter upptäckten av denna modifiering och dess mekanism, utfördes ytterligare forskning för att identifiera ett eller flera enzymer som främjar denna modifiering. Efter att ha identifierat enzymet som ansvarar för denna modifiering i både växter och marsvinshårsäckar, klonades det och karakteriserades i jäst och fick namnet ATE1 på grund av dess förmåga. Senare studier har också identifierat olika gener som kodar för ATE1-enzymer i flera arter, vilket leder till slutsatsen att ATE1 finns i alla eukaryoter.
Målwebbplatser
N-terminal
Vid identifieringen av de tidiga målen för arginylering av ATE1 (in vitro och in vivo) uppstod ett mönster. Detta mönster visade att ATE1 uppvisade en hög affinitet för proteiner och peptider innehållande de sura aminosyrorna asparagin eller glutamin som exponerades på den N-terminala sidan av proteinet eller peptiden. Ytterligare studier med hjälp av masspektrometri med hög precision har avslöjat hundratals proteiner från olika celler och vävnader som har arginylerats. Flera av dessa proteiner uppvisade också arginylering vid deras N-kedjeterminaler, men innehöll andra rester än asparagin eller glutamin. Som sådan är arginyleringsstudier fortfarande i de inledande stadierna och ytterligare forskning om specificiteten av arginylering måste utföras.
Emellertid begränsade antagandet att arginylering endast sker vid N-terminalen allvarligt mängden proteiner som sannolikt skulle arginyleras. Detta beror på det faktum att om preferensen för arginylering att endast ske vid N-terminalens antagande var sant, skulle arginylering aldrig kunna ske på intakta proteiner på grund av proteinsekvenser som börjar med metionin vid N-terminalen och inte den föredragna asparaginen eller glutaminen. Detta antagande visade sig snart vara falskt när ett protein upptäcktes med en arginylerad rest i mitten av dess sekvens.
Mellankedja
Även om N-terminal arginylering ursprungligen troddes vara den enda platsen för målsökning av ATE1-enzymer, har det nyligen upptäckts att arginylering också kan förekomma i mitten av peptidkedjan i ett protein. Den första upptäckten av denna oöverträffade modifiering inträffade när neurotensin, en biologisk peptid som finns i det centrala nervsystemet, isolerades från celler och det upptäcktes att arginin var fäst till en glutaminrest i mitten av kedjan. Denna upptäckt förändrade synen på hur arginylering sker, eftersom detta innebar att det kan finnas sätt att modifiera och arginylera intakta proteiner.
I ett försök att fastställa förekomsten av arginylering i mitten av kedjan, utfördes en masspektrometrisk screening av olika peptider. Resultaten från detta experiment avslöjade en uppsjö av olika proteiner som innehöll modifierade asparagin- och glutaminrester närvarande i mitten av deras peptidkedja, och ytterligare studier fastställde att ATE1 också kunde förmedla denna reaktion. Denna upptäckt förändrade faktiskt den biologiska omfattningen av arginylering genom att antyda att arginylering också kan ske på helt intakta proteiner, inte bara på N-terminalen av proteinfragment eller förbearbetade proteiner.
Konsekvenser
1986 klargjordes N-ändregeln och den säger att identiteten för aminosyran vid N-änden av proteinets aminosyrasekvens bestämmer halveringstiden för proteinet. I ett försök att bestämma effekterna av arginylering på halveringstiden för proteiner, utfördes flera studier med modifierade jästproteiner. Dessa studier visade att när proteiner konstruerades för att inkludera N-terminaler som hade arginylerats, var de modifierade proteinerna metaboliskt instabila. Dessutom upptäcktes det också att protein ubiquitination och nedbrytning blir mer sannolikt att inträffa när ett protein är arginylerat. Bevisen som samlats in från dessa experiment gör det klart att arginylering in vivo leder till nedbrytning av proteiner med asparagin- och glutaminrester vid deras N-terminaler.
Men det har också gjorts flera nya studier som har visat att proteinnedbrytning kanske inte är den vanliga funktionen av arginylering, men att denna modifiering också kan vara viktig för att vissa proteiner ska fungera korrekt. Till exempel, när arginylering sker på beta-amyloidproteiner , styrs proteinerna till sin rätta alfaspiralform och förhindras också från att felveckas och aggregeras. Ett annat protein som drar nytta av arginylering är calreticulin eftersom när det modifieras underlättas dess roll under endoplasmatisk retikulumstress , snarare än att det avlägsnas helt från cellerna. Eftersom både nedbrytnings- och underlättande effekter av arginylering har identifierats och studerats, är det tydligt att arginylering har en viktig roll i proteinreglering inom celler.
förordning
På grund av att det är en mindre förstådd posttranslationell modifiering förblir arginylering och dess reglering in vivo fortfarande till stor del esoterisk. Uttrycket av ATE1 kan variera avsevärt inom olika vävnader, men dess nivåer i dessa vävnader toppar i mitten av utvecklingen men börjar sjunka när en organism åldras. Det har också observerats att en mängd olika fysiologiska föreningar och läkemedel kan påverka inkorporeringen av arginin in vivo, men det antas att detta sker på ett icke-specifikt sätt. Som sådan har det föreslagits att inhibitorer och aktivatorer som reglerar ATE1-aktivitet, och därför arginylering, kan existera in vivo.
Arginylerings förmåga att göra proteiner metaboliskt instabila, som observerats i jäst, gör proteiner som har modifierats på detta sätt till ett attraktivt mål för borttagning. En av de väl karakteriserade arginyleringsregulatorerna är den ubiquitinberoende proteinnedbrytningen som snabbt bryter ned och tar bort skadliga proteiner. Denna viktiga regulator av arginylering underlättar specificiteten för denna posttranslationella modifiering och tar effektivt bort proteiner som inte var avsedda att arginyleras in vivo.
Slutligen föreslår en oprövad men mycket attraktiv mekanism för att reglera arginylering in vivo användningen av de-arginyleringsenzymer som kanske kan ta bort ett arginin som har tillsatts post-translationellt till proteiner. Enzymer såsom aminopeptidas B och karboxipeptidas B kan avlägsna arginin från en proteins N-terminal respektive från sidokedjekarboxylgrupper, men riktar sig inte specifikt mot arginylerade ställen. De föreslagna dearginyleringsenzymerna är teoretiserade att verka på samma sätt som de tidigare nämnda enzymerna Aminopeptidas B och Carboxypeptidas B, men skulle skilja sig åt i det faktum att de specifikt riktar sig mot arginylerade proteinsubstrat. Även om dessa enzymer ännu inte har upptäckts, är sökandet efter och upptäckten av dessa enzymer en spännande väg för vidare studier.
Vägar som regleras av
Ursprungligen avskriven som en icke-essentiell process på grund av ATE1-knockouten i jäst, senare studier har visat att arginylering spelar en betydande roll i flera biologiska processer. Knockouten av ATE1 hos möss och Drosophila resulterade i embryonal dödlighet för båda arterna. Ytterligare studier som använder musmodellen för att observera effekterna av ATE1-knockout i utvecklingen av organismen visade att genförlusten resulterade i onormal hjärt- och kraniofacial morfogenes, försämrad angiogenes och cellernas förmåga att genomgå meios . Postnatalt resulterade ATE1-knockout i viktminskning, infertilitet och mental retardation. Dessutom, observation av effekterna av ATE1-deletion i Arabidopsis thaliana , en modellväxtorganism, avslöjade defekt skott- och bladutveckling, onormal frönsgroning och försenad bladåldring. De dysfunktioner som härrör från knockouten av ATE1-enzymet tyder därför på att arginylering är nödvändig för många fysiologiska vägar inom eukaryoter.