Northwestern blot
Northwestern blot , även känd som northwestern-analysen , är en hybrid analytisk teknik av western blot och northern blot , och används inom molekylärbiologi för att detektera interaktioner mellan RNA och proteiner . En relaterad teknik, western blot, används för att detektera ett protein av intresse som involverar överföring av proteiner som separeras genom gelelektrofores till ett nitrocellulosamembran. En färgad fällning hopar sig längs bandet på membranet som innehåller ett speciellt målprotein. En northern blot är en liknande analytisk teknik som, istället för att detektera ett protein av intresse, används för att studera genuttryck genom detektion av RNA (eller isolerat mRNA) på ett liknande membran. Northwestern blotten kombinerar de två teknikerna och involverar specifikt identifiering av märkt RNA som interagerar med proteiner som är immobiliserade på ett liknande nitrocellulosamembran.
Historia
Edwin Southern skapade först Southern blot , en analytisk teknik som används för att detektera DNA. Tekniken innebär att man använder gelelektrofores , en viktig analysmetod som involverar användningen av ett elektriskt fält och den efterföljande migreringen av laddat DNA, RNA eller proteiner genom det elektriska fältet baserat på storlek och laddning. Med en Southern Blot överförs sedan de separerade DNA-fragmenten till ett filtermembran för detektion. Detektion sker när band blir synliga på membranet och korrelerar med en speciell molekyl av intresse. Därefter skapades andra liknande blottingtekniker med liknande nomenklatur för att detektera olika molekyler eller interaktioner mellan molekyler. Dessa tekniker inkluderar western blöt (proteindetektion), northern blöt (RNA-detektion), southwestern blöt (detektion av DNA-proteininteraktion), eastern blöt (detektion efter translationell modifiering) och northwestern blöt (detektion av RNA-proteininteraktion) .
Teknisk specifikation
RNA- bindande proteinerna separeras genom gelelektrofores , vilket kommer att separera de RNA-bindande proteinerna baserat på deras storlek och laddning. Individuella prover kan laddas i agaros- eller polyakrylamidgelen (vanligtvis en SDS-PAGE) för att analysera flera prover samtidigt. När gelelektroforesen är klar, överförs gelén och associerade RNA-bindande proteiner till ett nitrocellulosaöverföringspapper.
De nyligen överförda blottarna blötläggs sedan i en blockerande lösning; fettfri mjölk och bovint serumalbumin är vanliga blockerande buffertar. Denna blockerande lösning hjälper till att förhindra ospecifik bindning av de primära och/eller sekundära antikropparna till nitrocellulosamembranet. När den blockerande lösningen har tillräcklig kontakttid med blotten, appliceras ett specifikt konkurrerande RNA och får tid att inkubera vid rumstemperatur. Under denna tid binder det konkurrerande RNA:t till de RNA-bindande proteinerna i proverna som finns på blotten. Inkubationstiden under denna process kan variera beroende på koncentrationen av det applicerade konkurrent-RNA; även om inkubationstiden vanligtvis är en timme. Efter att inkubationen är klar tvättas blotten vanligtvis minst 3 gånger under 5 minuter varje tvätt, för att späda ut RNA:t i lösningen. Vanliga tvättbuffertar inkluderar fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller en 10 % Tween 20 -lösning. Felaktig eller otillräcklig tvätt kommer att påverka klarheten i utvecklingen av blotten. När tvätten är klar utvecklas blotten vanligtvis med röntgen eller liknande autoradiografimetoder .
Ansökningar
Efter att ha utvecklat blotten med hjälp av röntgen eller autoradiografi kan resultaten analyseras och tolkas för att bestämma den ungefärliga storleken och koncentrationen av det eller de RNA-bindande proteinerna av intresse för att ytterligare studera proteinet/proteinerna. Placeringen och koncentrationen av det RNA-bindande proteinet på blotten kan påverka resultaten, och band kan ibland uppstå efter utveckling. Dessa band kan hjälpa forskare att bestämma storleken och koncentrationen av det RNA-bindande proteinet av intresse. När den ungefärliga storleken på proteinet är känd kan det ursprungliga provet köras på en kromatografimaskin för att separera det efter storlek. När proteinet väl är isolerat kan det dessutom digereras med trypsin och masspektrometri kan användas för att sekvensera peptiderna för att bestämma identiteten för det specifika proteinet.
Fördelar och nackdelar
Fördelarna med northwestern blotting inkluderar snabb upptäckt av specifika proteiner som binder RNA, såväl som bedömningen av de ungefärliga molekylvikterna för dessa proteiner. Northwestern blot möjliggör detektering av identifierade proteiner på ett sätt som är billigt. Blotten är vanligtvis ett första steg i forskning, eftersom det möjliggör identifiering av de ungefärliga molekylvikterna, när molekylvikten väl är känd möjliggör den ytterligare forskning eller rening genom andra metoder som kromatografi. En annan fördel med northwestern blot är att den hjälper till att bygga upp expressionsbibliotek av besläktade ligander.
En noterad nackdel är att vissa RNA-proteininteraktioner med dåliga RNA-bindande egenskaper kanske inte är lika detekterbara med denna teknik. Också proceduren för blotting kan ta från 3 till 5 timmar. Om proceduren inte görs korrekt kan det resultera i betydande bakgrund som kan resultera i en oklar blott av de identifierade proteinerna. Dessutom måste proteiner återbildas efter att ha separerats och överförts till nitrocellulosamembranet. En sista nackdel är att proteiner måste bestå av en enda polypeptid eller två subenheter som komigrerar i gelmatrisen.
Se även
- Southern blot
- Western blot
- Northern blot
- Southwestern blot
- Östlig blot
- Gelelektrofores
- SDS-SIDA
- Kromatografi
Protokoll
Northwestern Blot of Protein-RNA Interaction from Young Rice Panicles
RNA-isolering och Northern Blot-analys