D-aminosyradehydrogenas
D-aminosyradehydrogenas (EC 1.4.99.1 ) är ett bakteriellt enzym som katalyserar oxidationen av D-aminosyror till deras motsvarande oxosyror . Den innehåller både flavin och nonheme järn som kofaktorer. Enzymet har en mycket bred specificitet och kan verka på de flesta D-aminosyror.
D-aminosyra + H 2 O + acceptor <=> en 2-oxosyra + NH 3 + reducerad acceptor
Denna reaktion skiljer sig från oxidationsreaktionen katalyserad av D-aminosyraoxidas som använder syre som ett andra substrat, eftersom dehydrogenaset kan använda många olika föreningar som elektronacceptorer, varvid det fysiologiska substratet är koenzym Q .
D-aminosyradehydrogenas är ett enzym som katalyserar NADPH från NADP+ och D-glukos för att producera D-aminosyror och glukosdehydrogenas. Några men inte begränsade till dessa aminosyror är D-leucin, D-isoleucin och D-valin, som är essentiella aminosyror som människor inte kan syntetisera på grund av att de inte ingår i deras kost. Dessutom katalyserar D-aminosyror bildandet av 2-oxo-syror för att producera D-aminosyror i närvaro av DCIP som är en elektronacceptor. D-aminosyror används som komponenter i farmaceutiska produkter, såsom antibiotika, antikoagulanter och bekämpningsmedel, eftersom de har visat sig vara inte bara mer potenta än deras L-enantiomerer, utan också mer motståndskraftiga mot enzymnedbrytning. D-aminosyradehydrogenasenzymer har syntetiserats via mutagenes med en förmåga att producera raka, grenade, cykliska alifatiska och aromatiska D-aminosyror. Solubiliserat D-aminosyradehydrogenas tenderar att öka dess affinitet för D-alanin, D-asparagin och D- -amino-n-butyrat.
I E. coli K12 är D-aminosyradehydrogenas mest aktivt med D-alanin som sitt substrat, eftersom denna aminosyra är den enda källan till kol, kväve och energi. Enzymet fungerar optimalt vid pH 8,9 och har en Michaelis-konstant för D-alanin lika med 30 mM. DAD upptäckt i gramnegativa E. coli B-membran kan också omvandla L-aminosyror till D-aminosyror.
Dessutom används D-aminosyradehydrogenas i Dye-Linked dehydrogenas (Dye-DHs) som använder artificiella färgämnen som 2,6-Dikloroindofenol (DCIP) som deras elektronacceptor snarare än att använda deras naturliga elektronacceptorer. Detta kan påskynda reaktionen mellan enzymet och substratet när elektronerna överförs.
Används i syntesreaktioner
D-aminosyradehydrogenas har visat sig vara effektivt i syntesen av grenkedjiga aminosyror såsom D-Leucin, D-Isoleucin och D-Valine. I den givna studien kunde forskarna framgångsrikt använda D-aminosyradehydrogenas för att skapa stora mängder av dessa produkter från utgångsmaterialet av 2-oxo-syror, i närvaro av ammoniak. Förutsättningarna för detta var varierande, även om de bästa resultaten visade sig vid cirka 65 °C.
Aminosyror erhållna genom dessa reaktioner resulterade i en hög enantioselektivitet på >99% och höga utbyten på >99%.
Med tanke på arten av detta enzym kan det vara möjligt att använda det för att skapa icke-grenade D-aminosyror såväl som modifierade D-aminosyror.
Erhålla D-aminosyradehydrogenas
I en studie, för att testa viabiliteten av att använda D-aminodehydrogenas i syntesreaktioner, använde forskare mutantbakterier för att erhålla och skapa olika stammar av enzymet. Dessa forskare fann att det bara krävdes fem mutationer för att modifiera det selektiva D-aminodehydrogenaset till att arbeta med andra D-aminosyror. De fann också att den behöll sin mycket selektiva natur, kapabel att ta emot mestadels D-enantiomerer efter mutation, med utbyten över 95 %.
En värmestabil variant av D-aminosyradehydrogenas hittades i bakterien Rhodothermus marinus JCM9785. Denna variant är involverad i katabolismen av trans-4-hydroxi-L-prolin.
Från de givna studierna, för att erhålla D-aminosyradehydrogenas, måste man först introducera och uttrycka det inom en given bakterieart, av vilka några har hänvisats till tidigare. Det måste sedan renas under gynnsamma förhållanden. Dessa är baserade på den speciella arten av D-aminosyradehydrogenas som används i ett givet forskningsexperiment. Under felaktiga förhållanden kan proteinet denaturera. Till exempel fann man att specifikt D-alanindehydrogenaser från E. coli och P. aeruginosa skulle förlora det mesta av sin aktivitet när de utsätts för förhållanden på 37 - 42 °C. Efter detta är det möjligt att separera och rena genom befintliga metoder.
Artificiellt D-aminosyradehydrogenas
På grund av nackdelarna med nuvarande metoder har forskare börjat arbeta med att skapa ett artificiellt enzym som kan producera samma D-aminosyror som enzymer från naturligt förekommande källor. Genom att lägga till fem aminosyror till ett givet prov isolerat från U. thermosphaericus lyckades de. Genom att modifiera aminosyrasekvensen kunde forskarna ändra specificiteten hos molekylen mot vissa reaktanter och produkter, vilket visar att det kan vara möjligt att använda artificiellt D-aminosyradehydrogenas för att screena för vissa D-aminosyraprodukter.
