Bottromycin
|
|
| Namn | |
|---|---|
| Andra namn Bottromycin A(2); Bottromycin A2-syra, metylester
|
|
| Identifierare | |
|
3D-modell ( JSmol )
|
|
| ChemSpider | |
|
PubChem CID
|
|
|
|
|
|
| Egenskaper | |
| C42H62N8O7S _ _ _ _ _ _ _ _ | |
| Molar massa | 823,05608 g.mol -1 |
|
Om inte annat anges ges data för material i standardtillstånd (vid 25 °C [77 °F], 100 kPa).
|
|
Bottromycin är en makrocyklisk peptid med antibiotisk aktivitet. Det upptäcktes först 1957 som en naturlig produkt isolerad från Streptomyces bottropensis . Det har visat sig hämma meticillinresistenta Staphylococcus aureus ( MRSA ) och vankomycinresistenta enterokocker ( VRE ) bland andra grampositiva bakterier och mykoplasma . Bottromycin är strukturellt skild från både vankomycin , ett glykopeptidantibiotikum , och meticillin , ett betalaktamantibiotikum .
Bottromycin binder till A-stället i ribosomen och blockerar bindningen av aminoacylt - RNA , vilket hämmar bakteriell proteinsyntes. Även om bottromycin uppvisar antibakteriell aktivitet in vitro , har det ännu inte utvecklats som ett kliniskt antibiotikum, potentiellt på grund av dess dåliga stabilitet i blodplasma. För att öka dess stabilitet in vivo har några bottromycinderivat undersökts.
Strukturen av bottromycin innehåller en makrocyklisk amidin såväl som en tiazolring . Den absoluta stereokemin vid flera kirala centra har fastställts från och med 2009. 2012 publicerades en tredimensionell lösningsstruktur av bottromycin. Lösningsstrukturen visade att flera metylgrupper finns på samma sida av strukturen.
Bottromycin faller inom den ribosomalt syntetiserade och post-translationellt modifierade peptidklassen av naturliga produkter.
Historia
Bottromycin isolerades först från Streptomyces bottropensis 1957. Det har sedan dess identifierats i åtminstone två andra medlemmar av släktet Streptomyces ; medlemmar av Streptomyces är kända för att vara produktiva producenter av sekundära metaboliter. Bottromycin har en unik struktur som består av den makrocykliska amidinkopplingen och fyra β-metylerade aminosyror. Bottromycin blockerar aminoacyl- t- RNA-bindning till ribosomen genom att binda till A-stället i 50-talets subenhet. Även om bottromycin upptäcktes för över 50 år sedan, fanns det en brist på forskning efter inledande studier på bottromycin fram till de senaste åren. Bristen på forskning är potentiellt ett resultat av bottromycins låga stabilitet i blodplasma. Den unika strukturen och verkningssättet har dock nyligen gjort bottromycin till ett mer mål för läkemedelsutveckling, särskilt med tanke på ökningen av antibiotikaresistens. [ citat behövs ]
Handlingsmekanism
Verkningsmekanismen för bottromycin bekräftades nästan 20 år efter upptäckten av bottromycin. Bottromycin fungerar som ett antibiotikum genom hämning av proteinsyntesen. Det blockerar aminoacyl t RNA-bindning till ribosomen genom att binda till A-stället i 50-talets subenhet. Detta resulterar i frisättning av aminoacyl- t -RNA från ribosomen och för tidig avslutning av proteinsyntesen. En jämförelse av andra antibiotika som är kända för att binda till A-stället i ribosomen, inklusive mikrokoccin, tetracyklin , streptomycin och kloramfenikol , antydde att endast bottromycin och kloramfenikol orsakade frisättning av aminoacyl- t -RNA från ribosomen. Av dessa antibiotika är endast mikrokoccin också en makrocyklisk peptid. [ citat behövs ]
Strukturbestämning
Bottromycin produceras naturligt som en serie produkter som skiljer sig i metyleringsmönster. Alla produkter innehåller valin- och fenylalaninmetylering. Bottromycin A2 är enskilt metylerad på prolin, bottromycin B saknar metylering på prolin och bottromycin C innehåller en dubbelmetylerad prolin. [ citat behövs ]
En partiell struktur av bottromycin rapporterades kort efter den första upptäckten av bottromycin. De första strukturella studierna förlitade sig på traditionella analysmetoder. Dess peptidliknande struktur, inklusive närvaron av glycin och valin, föreslogs först av en kombination av sur hydrolys , acetylering , ninhydrinfärgning och papperskromatografi , bland andra experiment. Närvaron av en tiazolring, tillsammans med en intilliggande β-metylerad fenylalanin, fastställdes genom ninhydrinfärgning, kaliumpermanganatoxidation och jämförelse med syntetiska standarder. En metylestersubstituent rapporterades 1958. Samma studie rapporterade också att Kunz-hydrolysprodukten som saknade en metylester var biologiskt inaktiv. Nakamura och kollegor rapporterade senare att bottromycin innehöll tert-leucin och cis -3-metylprolin. De föreslog också en linjär iminohexapeptidstruktur.
Dessa tidiga strukturstudier följdes inte upp förrän på senare år med det förnyade intresset för bottromycin. Strukturen bekräftades på 1980- och 1990-talen vara en cyklisk iminopeptid baserad på NMR-studier, med en linjär sidokedja kopplad till makrocykeln via en amidinkoppling.
Dess absoluta stereokemi karakteriserades dock inte förrän 2009. Stereokemi vid kol 18 och 25 föreslogs genom att jämföra förutspådda konformers erhållna med molekylär dynamik med experimentella begränsningar erhållna genom NMR-experiment. Stereokemi vid kol 43 bekräftades genom att jämföra ' H NMR av autentisk hydrolysprodukt med ett kemiskt syntetiserat prov av samma fragment. Slutligen matchade experiment med optisk rotation, ' H NMR och HRMS av kemiskt syntetiserat bottromycin det för biologiskt producerat bottromycin. [ citat behövs ]
Den tredimensionella lösningsstrukturen för bottromycin A2 löstes med NMR 2012. Den övergripande strukturen erhölls med god upplösning (RMSD 0,74±0,59 Å), med en RMSD på 0,09±0,06 Å för makrocykeln. I denna studie föreslogs att den metylerade prolinresten bidrog till den begränsade konformationen av makrocykeln. De metylerade prolin- och β-OMe-alaninresterna visade sig vara på samma yta av bottroymycin A2 och det föreslogs att denna egenskap bidrog till bindning av bottromycin till det ribosomala A-stället.
Biosyntes
Produktionen av bottromycin av S. bottropensis och S. scabies , såväl som produktionen av en bottromycinanalog benämnd bottromycin D, har studerats. Det bekräftades oberoende 2012 av flera grupper att bottromycin produceras som en naturlig ribosomal peptidprodukt som det sedan modifierade posttranslationellt. Innan detta var det oklart om bottromycin producerades av icke-ribosomalt peptidsyntetasmaskineri (NRPS). Närvaron av andra aminosyror än de 20 proteinogena aminosyrorna är ofta ett kännetecken för NRPS-produkter eftersom NRPS-maskineri direkt kan inkorporera andra aminosyror, bland andra kemiska byggstenar. Ribosomal peptidsyntes, som är samma maskineri som producerar alla proteiner som finns i cellen, är begränsad till de 20 proteinogena aminosyrorna. Bottromycin visade sig dock vara en mycket modifierad ribosomal peptid genom en kombination av genombrytning och studier av gendeletion.
Vid syntes av ribosomal peptid resulterar den slutliga produkten från modifieringar av ett linjärt peptidutgångsmaterial som translaterats av ribosomen från ett mRNA-transkript. I S. scabies är prekursorpeptiden, benämnd BtmD, en peptid med 44 aminosyror. Prekursorpeptiden kallas BmbC i S. bottropensis . Aminosyrorna som bildar bottromycinkärnan är resterna 2-9 i BtmD: Gly-Pro-Val-Val-Val-Phe-Asp-Cys. I bottromycin D är sekvensen Gly-Pro-Ala-Val-Val-Phe-Asp-Cys, och prekursorpeptiden benämns BstA. BstA delar högsekvenshomologi med BtmD i efterföljarpeptidregionen. Till skillnad från andra naturliga ribosomala peptidprodukter, som normalt syntetiseras med en ledarpeptid som spjälkas, syntetiseras bottromycin med en efterföljande peptid. Närvaron av en efterföljande peptid identifierades genom bioinformatisk analys av det biosyntetiska bottromycinklustret.
Det fullständiga biosyntetiska genklustret för bottromycin har identifierats. Det förutspås innehålla 13 gener, inklusive prekursorpeptiden (notation kommer att följa Crone och kollegor; andra studier hade liknande resultat). En av generna i klustret, btmL , föreslås vara en transkriptionell regulator . En annan gen, btmA , föreslås exportera bottromycin. De återstående tio generna förväntas modifiera prekursorpeptiden btmD från en linjär peptid till den slutliga makrocykliska produkten.
| S. skabb | S. bottropensis | WMMB272 | Förutspådd funktion |
|---|---|---|---|
| btmA | bmbT | bstK | Stor facilitator superfamilj/transportör |
| btmB | bmbA | bstB | o- Metyltransferas |
| btmC | bmbB | bstC | Radikal SAM-metyltransferas |
| btmD | bmbC | bstA | Prekursorpeptid |
| btmE | bmbD | bstD | YcaO-domän |
| btmF | bmbE | bstE | YcaO-domän |
| btmG | bmbF | bstF | Radikal SAM-metyltransferas |
| btmH | bmbG | bstG | a/p-hydrolas |
| btmI | bmbH | bstH | Metallberoende hydrolas |
| btmJ | bmbI | bstI | Cytokrom P450 |
| btmK | bmbJ | bstJ | Radikal SAM-metyltransferas |
| btmL | bmbR | Transkriptionsregulator | |
| btmM | bmbK | M17 aminopeptidas |
En biosyntesväg har antagits baserat på föreslagna genfunktioner (se figur). btmM , med homologi med Zn+2-aminopeptidaser, förutsägs klyva den N-terminala metioninresten, som inte är närvarande i bottromycinslutprodukten. btmE och btmF innehåller båda YcaO- liknande domäner. Man tror att ett. Även om det är oklart vilket enzym som är ansvarigt för vilket steg, antas det att det ena katalyserar makrocyklisk amidinbildning medan det andra katalyserar tiazolinbildning. btmJ , som kodar för ett enzym med cytokrom P450-homologi, kan oxidera tiazolinen till tiazolen. btmH eller btmI har båda homologi med hydrolytiska enzymer (a/p-hydrolas respektive metalloberoende hydrolas) kan katalysera efterföljande peptidhydrolys. En alternativ föreslagen roll för btmH eller btmI är att fungera som ett cyklodehydratas vid makrocyklisering. Gendeletionsstudier misslyckades med att belysa funktionen av andra proteiner i klustret.
Metyltransferaser i det biosyntetiska klustret
Bioinformatisk analys identifierade fyra metyltransferaser inom klustret. Bioinformatik tyder på att btmB är ett O -metyltransferas , medan de andra tre, btmC , G och K , är radikal S -adenosylmetionin (SAM) metyltransferaser . Radikal SAM-metyltransferaserna tros p-metylera aminosyrarester i prekursorpeptiden. btmC tros metylera fenylalanin, btmG tros metylera båda valinerna och btmK tros metylera prolin baserat på gendeletionsstudier.
De tre förmodade radikala SAM-metyltransferaserna som kodas inom vägen är intressanta av både mekanistiska och biosyntetiska skäl. Radikala SAM-metyltransferaser metylerar sannolikt substrat med en ovanlig mekanism. Biosyntetiskt är β-metyleringar av aminosyror mycket ovanliga i naturliga produkter. Polyteonamid B, en peptidnaturprodukt producerad av en marin symbiont, är det enda andra strukturellt karakteriserade exemplet på direkt β-metylering av en peptidnaturprodukt. Den föreslagna metylöverföringen från ett SAM-användande enzym stöddes av tidigare utfodringsstudier med märkt metionin; märkt metionin används eftersom metionin omvandlas till SAM i celler. Vidare använde denna studie stereospecifikt märkt metionin ([metyl-( 2H - 3H )]-(2S , metyl- R )-metionin) för att visa att metylering skedde med en nettoretention av stereokemi vid metylgruppen. Författaren spekulerade i att nettoretention indikerade en radikal mekanism med en B12-mellanprodukt. Radikalöverföring med en kobalamin B12-kofaktor och SAM har visats med de få karakteriserade radikal-SAM-metyltransferaserna. Även om bevisen pekar på radikal β-metylering under bottromycinbiosyntes, återstår det att se om bioinformatiska hypoteser och utfodringsstudier kommer att stödjas av in vitro -aktivitetsanalyser.
Val3Ala-substitutionen i bottromycin D ändrar inte β-metyleringsmönstret mellan bottromycin A2 och D eftersom Val3 är den enda valin som inte är metylerad i bottromycin A2. Som sådan finns det fortfarande tre förutspådda radikala SAM-beroende enzymer i det biosyntetiska klustret av bottromycin D: bstC , bstF och bstJ .
Från och med 2013 har alla publicerade biosyntetiska studier varit bioinformatiska eller cellbaserade. Inga biokemiska analyser som direkt visar proteinfunktion har ännu publicerats. Det är troligt att in vitro -mekanistiska studier för att bättre belysa den biosyntetiska vägen kommer att ske.
Total syntes
Den totala syntesen av bottromycin genomfördes 2009. Syntesen uppnåddes i 17 steg. Även om bottromycin är en peptidbaserad naturprodukt, innehåller den en ovanlig makrocykel och tiazolheterocykel, så att den totala syntesen inte kunde åstadkommas med traditionell fastfaspeptidsyntes . Syntesen åstadkoms med användning av en kombination av peptidkoppling och andra metoder. utfördes en sekvens av kondensation, Mannich-reaktion och palladiumkatalyserade dekarboxyleringssteg. Denna mellanprodukt framställdes stereoselektivt. För att erhålla amidinkopplingen kopplades en tripeptidmellanprodukt till en ftaloylskyddad tioamid via kvicksilvermedierad kondensation med användning av kvicksilver(II)trifluormetansulfonat ( Hg(OTf) 2 ) för att ge en grenad amidinmellanprodukt. För att erhålla den slutliga produktens makrocykel krävdes makrolaktamisering av den amidininnehållande mellanprodukten. iPr2NEt . Makrolaktamisering utfördes med 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDCI) och gav slutprodukten, bottromycin A2 För att bekräfta att det syntetiserade bottromycin A2 hade samma stereokemi som naturligt bottromycin A2, studerades produkten genom optisk rotation , 1H och 13C NMR, IR och HRMS. Uppgifterna befanns matcha de för isolerat bottromycin A2. Vidare visade sig det syntetiska provet av bottromycin också ha antibakteriell aktivitet mot både MRSA och VRE, även om kvantitativa data inte rapporterades. En fullständig återgivning av det syntetiska schemat kan ses under länken för kollapsat syntetiskt schema.
| Bottromycinsyntesschema som beskrivs av Shimamura et al. |
|---|
Under 2012 rapporterades en alternativ syntes av bottromycinets makrocykliska ringsystem och amidinkoppling. Syntesen uppnåddes i 10 steg. Till skillnad från den tidigare syntesen, syntetiserade Ackerman och kollegor en linjär peptid och uppnådde intramolekylär amidinbildning med hjälp av en S -metylerad endotiopeptid. Endotiopeptiden erhölls genom en tio-Ugi-reaktion . Den resulterande makrocykeln erhölls som en racemisk blandning vid amidinbindningen. Det fullständiga syntetiska schemat kan ses under länken för kollapsat syntetiskt schema.
| Syntetiskt schema för alternativ bottromycin makrocykelsyntes rapporterat av Ackermann et al. |
|---|
Derivat
Efter den totala syntesen av bottromycin syntetiserade Kobayashi och kollegor en serie bottromycinderivat och utvärderade deras anti-MRSA- och anti-VRE-aktivitet. Endast derivat av metylesterdelen undersöktes, eftersom de fann att metylestern var både viktig för antibakteriell aktivitet och instabil i blodplasma. En serie av sjutton derivat syntetiserades, med derivat indelade i tre allmänna kategorier: amidderivat , ureaderivat och ketonderivat . Alla analoger förutom karboxylsyra- och hydrazidanalogerna derivatiserades från isolerad bottromycin A2 med användning av en aktiverad azidester. Derivaten testades mot sex grampositiva bakteriestammar: Staphylococcus aureus FDA209P, S. aureus Smith, MRSA HH-1, MRSA 92-1191, Enterococcus faecalis NCTC12201 och E. faecalis NCTC12203 (både VRE).
Bottromycin A2 hade låg mikromolär aktivitet mot alla testade stammar, från ett MIC på 0,5 μg/ml i E. faecalis NCTC12203 till 2 μg/ml i MRSA HH-1. Amid- och ureaderivatfamiljerna visade sig ha svagare antibakteriell aktivitet än bottromycin A2 mot S. aureus , MRSA och VRE. MIC-värdena för amid- och ureaderivaten var i allmänhet fyra gånger högre än för bottromycin A2. De var dock betydligt mer stabila i musplasma än bottromycin A2. Bottromycin A2 bröts ned fullständigt i musplasma efter 10 minuter och uppvisade 0 % kvarvarande aktivitet efter exponering för råttserum. Endast ett derivat hade lägre än 50 % kvarvarande aktivitet. Däremot behöll många derivat en betydande andel av kvarvarande anti-MRSA-aktivitet efter exponering för serum. Tioestermellanprodukter till ketonderivaten visade sig vara instabila och uppvisade 0 % kvarvarande aktivitet, även om de hade förbättrad antibakteriell aktivitet, uppvisade submikromolära MIC-värden. Propylketonen visade sig vara det mest lovande derivatet av alla erhållna analoger, som båda uppvisade antibakteriell aktivitet mot de testade bakteriestammarna och stabilitet i plasma, med bibehållande av 100 % kvarvarande aktivitet. MIC-värdena som erhölls för propylderivatet var desamma som de som hittades för bottromycin A2 förutom i fallet med NCTC12201, som hade en MIC på 2 μg/mL för derivatet och en MIC på 1 μg/mL för bottromycin A2. En sammanfattning av MIC-värden för testade bakteriestammar visas nedan.
Även de minst aktiva bottromycinderivaten uppvisade större anti-VRE-aktivitet än vankomycin, som användes som kontrollantibiotikum i denna studie. Propylderivatet och bottromycin A2 hade liknande antimikrobiell aktivitet som linezolid , ett syntetiskt antibiotikum som är aktivt mot grampositiva bakterier inklusive MRSA och VRE, över alla de studerade bakteriestammarna. Sammantaget antydde resultaten av denna studie att ytterligare modifieringar av bottromycin kan leda till ett mer stabilt, effektivt antibiotikum.
| Förening | S. aureus FDA209P (μg/mL) | S. aureus Smith (μg/ml) | MRSA HH-1 (μg/ml) | MRSA 92-1191 (μg/ml) | VRE NCTC12201 (μg/mL) | VRE NCTC12203 (μg/mL) | Återstående anti-MRSA-aktivitet (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Bottromycin A2 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 0,5 | 0 |
| Hydrolyserad bottromycin A2 (karboxylsyra) | 64 | 64 | 64 | 128 | 128 | 32 | - |
| Propylderivat | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 0,5 | 100 |
| Vancomycin | 1 | 1 | 0,5 | 1 | >128 | >128 | - |
| Linezolid | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | - |
Ett naturligt derivat av bottromycin, bottromycin D, har också identifierats. Den produceras i en marin Streptomyces- art, stam WMMB272. Även om metylestern fortfarande finns i bottromycin D, är en av de makrocykliska valinerna muterad till en alanin. Den minsta hämmande koncentrationen (MIC) för bottromycin D bestämdes och visade sig vara endast något mindre aktiv än bottromycin A2 (2 μg/mL för bottromycin D vs. 1 μg/mL för bottromycin A2). Författarna postulerade att större konformationsflexibilitet för bottromycin D kan vara ansvarig för dess lägre aktivitet.
Inga ytterligare antibakteriella studier av syntetiska eller biosyntetiska bottromycinderivat har rapporterats i litteraturen från och med 2013. Sökandet efter effektiva analoger kommer att möjliggöras av bottromycins status som en ribosomal peptid. Analoger kan utforskas biosyntetiskt genom att ändra sekvensen för prekursorpeptiden; en förändring i aminosyrasekvensen leder direkt till en modifierad bottromycinstruktur.
Klinisk potential
Från och med 2013 har bottromycin inte godkänts för några kliniska tillämpningar, och det har inte heller testats på människor. In vivo- stabiliteten för bottromycin måste förbättras innan det kan betraktas som en läkemedelskandidat. Arbete av Kobayashi och kollegor har redan börjat för att ta itu med denna fråga, men mer arbete kan pågå. Behovet av att hitta nya antibiotika för att bekämpa antibiotikaresistens innebär att det biologiska och syntetiska intresset för bottromycin sannolikt kommer att fortsätta. En kombination av biologiska och syntetiska tekniker kan ge både en effektiv och stabil bottromycinanalog för utveckling som en potentiell läkemedelskandidat.