Agaros
.jpg)
Agaros är en heteropolysackarid , vanligtvis extraherad från vissa röda alger . Det är en linjär polymer som består av den upprepande enheten av agarobios, som är en disackarid som består av D -galaktos och 3,6-anhydro- L -galaktopyranos. Agaros är en av de två huvudkomponenterna i agar och renas från agar genom att ta bort agars andra komponent, agaropektin .
Agaros används ofta i molekylärbiologi för separation av stora molekyler, särskilt DNA , genom elektrofores . Skivor av agarosgeler (vanligtvis 0,7 - 2%) för elektrofores framställs lätt genom att hälla den varma, flytande lösningen i en form. Ett brett utbud av olika agaroser med varierande molekylvikter och egenskaper är kommersiellt tillgängliga för detta ändamål. Agaros kan också formas till pärlor och användas i ett antal kromatografiska metoder för proteinrening .
Strukturera
Agaros är en linjär polymer med en molekylvikt på cirka 120 000, bestående av alternerande D - galaktos och 3,6-anhydro- L -galaktopyranos kopplade med α-(1→3) och β-(1→4) glykosidbindningar. 3,6-anhydro- L -galaktopyranosen är en L -galaktos med en anhydrobrygga mellan 3 och 6 positionerna, även om vissa L -galaktosenheter i polymeren kanske inte innehåller bryggan. Vissa D -galaktos- och L -galaktosenheter kan metyleras , och pyruvat och sulfat finns också i små mängder.
Varje agaroskedja innehåller ~800 molekyler galaktos, och agarospolymerkedjorna bildar spiralformade fibrer som aggregerar till en superspiralstruktur med en radie på 20-30 nm . Fibrerna är kvasistyva och har ett brett längdområde beroende på agaroskoncentrationen. När de stelnat bildar fibrerna ett tredimensionellt nät av kanaler med diameter från 50 nm till >200 nm beroende på koncentrationen av agaros som används - högre koncentrationer ger lägre genomsnittliga pordiametrar. 3D-strukturen hålls samman med vätebindningar och kan därför avbrytas genom att värmas tillbaka till flytande tillstånd.
Egenskaper
Agaros finns som ett vitt pulver som löser sig i nästan kokande vatten och bildar en gel när det svalnar. Agaros uppvisar fenomenet termisk hysteres i sin vätske-till-gel-övergång, dvs den gelar och smälter vid olika temperaturer. Gelnings- och smälttemperaturerna varierar beroende på typen av agaros. Standardagaroser härledda från Gelidium har en gelningstemperatur på 34–38 °C (93–100 °F) och en smälttemperatur på 90–95 °C (194–203 °F), medan de som härrör från Gracilaria , på grund av dess högre metoxisubstituenter , har en gelningstemperatur på 40–52 °C (104–126 °F) och en smälttemperatur på 85–90 °C (185–194 °F). Smält- och gelningstemperaturerna kan vara beroende av koncentrationen av gelén, speciellt vid låg gelkoncentration på mindre än 1%. Gelnings- och smälttemperaturerna ges därför vid en specificerad agaroskoncentration.
Naturlig agaros innehåller oladdade metylgrupper och graden av metylering är direkt proportionell mot gelningstemperaturen. Syntetisk metylering har dock den omvända effekten, varigenom ökad metylering sänker gelningstemperaturen. En mängd olika kemiskt modifierade agaroser med olika smält- och gelningstemperaturer är tillgängliga genom kemiska modifieringar.
Agarosen i gelén bildar ett nät som innehåller porer, och storleken på porerna beror på koncentrationen av tillsatt agaros. När de står är agarosgelerna benägna att syneres (extrudering av vatten genom gelytan), men processen är tillräckligt långsam för att inte störa användningen av gelén.
Agarosgel kan ha hög gelstyrka vid låg koncentration, vilket gör den lämplig som antikonvektionsmedium för gelelektrofores . Agarosgeler så utspädda som 0,15 % kan bilda plattor för gelelektrofores. Agarospolymeren innehåller laddade grupper, i synnerhet pyruvat och sulfat . Dessa negativt laddade grupper kan bromsa rörelsen av DNA-molekyler i en process som kallas elektroendosmos (EEO), och låg EEO agaros är därför generellt att föredra för användning i agarosgelelektrofores av nukleinsyror . Noll EEO agaroser är också tillgängliga men dessa kan vara oönskade för vissa tillämpningar eftersom de kan göras genom att lägga till positivt laddade grupper som kan påverka efterföljande enzymreaktioner. Elektroendosmos är en anledning till att agaros används framför agar eftersom agaropektin i agar innehåller en betydande mängd negativt laddade sulfat- och karboxylgrupper. Avlägsnandet av agaropektin i agaros minskar EEO avsevärt, samt minskar den icke-specifika adsorptionen av biomolekyler till gelmatrisen. För vissa tillämpningar, såsom elektrofores av serumprotein, kan emellertid en hög EEO vara önskvärd och agaropektin kan tillsättas i den använda gelén.
Agaroser med låg smält- och gelningstemperatur
Smält- och gelningstemperaturerna för agaros kan modifieras genom kemiska modifieringar, oftast genom hydroxietylering, vilket minskar antalet intrasträngade vätebindningar, vilket resulterar i lägre smält- och härdningstemperaturer jämfört med standardagaroser. Den exakta temperaturen bestäms av graden av substitution, och många tillgängliga lågsmältningspunkt (LMP) agaroser kan förbli flytande vid 30–35 °C (86–95 °F) intervallet. Denna egenskap tillåter enzymatiska manipulationer att utföras direkt efter DNA-gelelektroforesen genom att lägga till skivor av smält gel innehållande DNA-fragment av intresse till en reaktionsblandning. LMP-agarosen innehåller färre av de sulfater som kan påverka vissa enzymatiska reaktioner och används därför helst för vissa tillämpningar.
Hydroxietylerad agaros har också en mindre porstorlek (~90 nm) än standardagaroser. Hydroxietylering kan minska porstorleken genom att minska packningsdensiteten hos agarosknippena, därför kan LMP-gel också ha en effekt på tiden och separationen under elektrofores. Agaroser med ultralåg smältande eller gelningstemperatur kan endast gela vid 8–15 °C (46–59 °F).
Ansökningar
Agaros är en föredragen matris för arbete med proteiner och nukleinsyror eftersom den har ett brett spektrum av fysisk, kemisk och termisk stabilitet, och dess lägre grad av kemisk komplexitet gör det också mindre benäget att interagera med biomolekyler . Agaros används oftast som medium för elektroforetisk separation i analytisk skala vid agarosgelelektrofores . Geler gjorda av renad agaros har en relativt stor porstorlek, vilket gör dem användbara för separation av stora molekyler, såsom proteiner och proteinkomplex >200 kilodalton, såväl som DNA-fragment >100 baspar. Agaros används också i stor utsträckning för ett antal andra tillämpningar, till exempel immundiffusion och immunelektrofores , eftersom agarosfibrerna fungerar som ett ankare för immunkomplex .
Agarosgelelektrofores
Agarosgelelektrofores är rutinmetoden för att lösa upp DNA i laboratoriet. Agarosgeler har lägre upplösningsförmåga för DNA än akrylamidgeler, men de har större separeringsintervall och används därför vanligtvis för DNA-fragment med längder på 50–20 000 bp ( baspar ), även om upplösning på över 6 Mb är möjlig med pulsad fältgelelektrofores (PFGE). Det kan också användas för att separera stora proteinmolekyler, och det är den föredragna matrisen för gelelektrofores av partiklar med effektiva radier större än 5-10 nm.
Gelens porstorlek påverkar storleken på det DNA som kan siktas. Ju lägre koncentration av gelen, desto större porstorlek, och desto större DNA som kan siktas. Lågkoncentrationsgeler (0,1 - 0,2%) är dock ömtåliga och därför svåra att hantera, och elektroforesen av stora DNA-molekyler kan ta flera dagar. Upplösningsgränsen för standard agarosgelelektrofores är cirka 750 kb. Denna gräns kan övervinnas med PFGE, där alternerande ortogonala elektriska fält appliceras på gelén. DNA-fragmenten omorienterar sig själva när det applicerade fältet byter riktning, men större DNA-molekyler tar längre tid att anpassa sig när det elektriska fältet förändras, medan det för mindre är snabbare, och DNA:t kan därför fraktioneras efter storlek.
Agarosgeler gjuts i en form och körs vanligtvis horisontellt nedsänkt i en buffertlösning när de stelnat. Tris-acetat-EDTA och Tris-Borate-EDTA- buffertar används ofta, men andra buffertar som tris-fosfat, barbitursyra-natriumbarbiturat eller tris- barbituratbuffertar kan användas i andra tillämpningar. DNA:t visualiseras normalt genom färgning med etidiumbromid och betraktas sedan under UV-ljus , men andra färgningsmetoder finns tillgängliga, såsom SYBR Green , GelRed , metylenblått och kristallviolett . Om de separerade DNA-fragmenten behövs för ytterligare experiment nedströms, kan de skäras ut från gelén i skivor för ytterligare manipulation.
Proteinrening
Agarosgelmatris används ofta för proteinrening , till exempel vid kolonnbaserad preparativ skalseparation som vid gelfiltreringskromatografi , affinitetskromatografi och jonbyteskromatografi . Den används dock inte som en kontinuerlig gel, utan den formas till porösa pärlor eller hartser med varierande finhet. Pärlorna är mycket porösa så att protein kan flöda fritt genom pärlorna. Dessa agarosbaserade pärlor är vanligtvis mjuka och lätt att krossa, så de bör användas under gravitationsflöde, låghastighetscentrifugering eller lågtrycksprocedurer. Hartsernas styrka kan förbättras genom ökad tvärbindning och kemisk härdning av agaroshartserna, men sådana förändringar kan också resultera i en lägre bindningskapacitet för protein i vissa separationsprocedurer såsom affinitetskromatografi .
Agaros är ett användbart material för kromatografi eftersom det inte absorberar biomolekyler i någon betydande utsträckning, har goda flytegenskaper och kan tolerera extrema pH och jonstyrka såväl som höga koncentrationer av denatureringsmedel såsom 8M urea eller 6M guanidin HCl . Exempel på agarosbaserad matris för gelfiltreringskromatografi är Sepharose och WorkBeads 40 SEC (tvärbunden pärlagaros), Praesto och Superose (mycket tvärbundna pärlagaroser) och Superdex ( dextran kovalent kopplad till agaros).
För affinitetskromatografi är agaros med pärlor det mest använda matrishartset för att fästa de ligander som binder protein. Liganderna är kopplade kovalent genom en spacer till aktiverade hydroxylgrupper i agarospärlpolymer. Proteiner av intresse kan sedan bindas selektivt till liganderna för att separera dem från andra proteiner, varefter det kan elueras. Agarospärlorna som används har typiskt 4% och 6% densiteter med hög bindningskapacitet för protein.
Gedigna kulturmedier
Agarosplatta kan ibland användas istället för agar för att odla organismer eftersom agar kan innehålla föroreningar som kan påverka tillväxten av organismen eller vissa nedströmsprocedurer såsom polymeraskedjereaktion ( PCR). Agaros är också hårdare än agar och kan därför vara att föredra där större gelstyrka är nödvändig, och dess lägre gelningstemperatur kan förhindra att organismen orsakar termisk chock när cellerna suspenderas i vätska före gelning. Den kan användas för odling av strikta autotrofa bakterier, växtprotoplast , Caenorhabditis elegans , andra organismer och olika cellinjer.
Motilitetsanalyser
Agaros används ibland istället för agar för att mäta mikroorganismernas rörlighet och rörlighet. Motila arter kommer att kunna migrera, om än långsamt, genom den porösa gelén och infiltrationshastigheter kan sedan visualiseras. Gelens porositet är direkt relaterad till koncentrationen av agar eller agaros i mediet, så olika koncentrationsgeler kan användas för att bedöma en cells sim- , svärm- , glid- och ryckmotilitet. Under-agaroscellmigreringsanalys kan användas för att mäta kemotaxi och kemokines. Ett lager av agarosgel placeras mellan en cellpopulation och en kemoattraktant . När en koncentrationsgradient utvecklas från diffusionen av kemoattraktanten in i gelén, kan olika cellpopulationer som kräver olika stimuleringsnivåer för att migrera visualiseras över tiden med hjälp av mikrofotografi när de tunnlar uppåt genom gelén mot gravitationen längs gradienten.
Se även
| Myndighetskontroll : Nationella bibliotek |
|---|
