SBP-tagg
Streptavidin -bindande peptid (SBP)-taggen är en sekvens på 38 aminosyror som kan manipuleras till rekombinanta proteiner . Rekombinanta proteiner som innehåller SBP-taggen binder till streptavidin och denna egenskap kan användas i specifika renings-, detektions- eller immobiliseringsstrategier. [ citat behövs ]
Sekvensen för SBP-taggen är MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP.
Upptäckt
Den Streptavidin-bindande peptiden upptäcktes i ett bibliotek av sju biljoner stokastiskt genererade peptider med användning av in vitro-selektionstekniken för mRNA Display . Selektion utfördes genom inkubering med streptavidin-agaros följt av eluering med biotin . SBP-taggen har visats binda streptavidin med en jämviktsdissociationskonstant på 2,5 nM och elueras lätt med biotin under naturliga förhållanden.
Ansökningar
Proteinrening
På grund av de milda elueringsförhållandena (biotin plus tvättbuffert) kan SBP-märkta proteiner genereras i ett relativt rent tillstånd med ett enda reningssteg. Det finns flera relativt rikliga däggdjursproteiner som i sig associeras med IMAC- matriserna som binder till den mer vanligt använda Polyhistidine-taggen (His-tag). Av denna anledning föredras ofta icke-IMAC-reningsprotokoll, inklusive med SBP-taggen, för proteiner som uttrycks i däggdjursceller. [ citat behövs ]
Rening av proteinkomplex
Komplex av interagerande proteiner kan också renas med användning av SBP-taggen eftersom eluering med biotin tillåter återhämtning under förhållanden där önskade komplex förblir associerade. Till exempel renades kondensinkomplexet av Kim et al. [2010] och komplex med TAZ -transkriptionskoaktivatorn renades av Zhang et al. [2009]. SBP-taggen har också inkorporerats i flera tandemaffinitetsreningssystem (TAP) där successiva reningssteg används med flera taggar, till exempel renades GFP -fusionsproteiner och BTK -proteinkomplex med ett TAP-protokoll med SBP-taggen och His-Tag, HDGF -proteinkomplexen renades med användning av ett TAP-protokoll med SBP-Tag och med FLAG-tag och Wnt -komplex renades med användning av ett TAP-protokoll med SBP-Tag och med [Calmodulin-Tag]. TAP används vanligtvis med proteinkomplex och flera studier rapporterar betydande förbättringar i renhet och utbyte när SBP-Tag TAP-systemen jämförs med icke-SBP-Tag-system. Kommersiella TAP-system som använder SBP-taggen inkluderar Interplay® Adenoviral och Mammalian TAP-system som säljs av Agilent Technologies , liknande produkter säljs av Sigma-Aldrich .
Proteomics
Screeningar för biologiskt relevanta protein-protein-interaktioner har utförts med tandemaffinitetsrening (TAP) med SBP-taggen och protein A , för interaktionsproteomik och transkriptionsfaktorkomplex med SBP-taggen och protein G , för proteiner som interagerar med denguefeber . Virusprotein DENV-2 NS4A med SBP-taggen och Calmodulin-taggen. och för proteiner som interagerar med proteinfosfatas 2A (PP2A) med SBP-taggen och hemagglutinin (HA)-taggen.
Avbildning
SBP-taggen kommer också att binda till streptavidin eller streptavidinreagens i lösning. Tillämpningar av dessa konstruerade associationer inkluderar visualisering av specifika proteiner i levande celler, övervakning av kinetiken för translationen av individuella proteiner i ett in vitro-translationssystem, kontroll av integrationen av ett flerspännande membranprotein i det endoplasmatiska retikulumet genom att fusionera SBP-tag till den N-terminala translokationssekvensen och sedan stoppa integrationen med streptavidin och återstarta integrationen med biotin. Fluorescerande streptavidinreagens (t.ex. streptavidin-HRP) kan användas för att visualisera SBP-taggen genom immunoblotting av SDS-PAGE. Dessutom finns antikroppar mot SBP-taggen kommersiellt tillgängliga. [ citat behövs ]
Ytplasmonresonans
SBP-taggen har använts för att reversibelt immobilisera rekombinanta proteiner på streptavidin-funktionaliserade ytor och därigenom möjliggöra interaktionsbedömning såsom genom ytplasmonresonans (SPR)-tekniker med återanvändning av den funktionaliserade ytan. SPR har också använts för att jämföra SBP-taggen med andra streptavidinbindande peptider såsom Strep-tag .
Se även
Vidare läsning
- Kim, Ji Hun; Chang, Tsz M; Graham, Alison N; Choo, K HA; Kalitsis, Paul; Hudson, Damien F (2010). "Streptavidin-bindande peptid (SBP)-märkt SMC2 tillåter enkelstegs affinitetsfluorescens, blotting eller rening av kondensinkomplexet" . BMC Biokemi . 11 : 50. doi : 10.1186/1471-2091-11-50 . PMC 3022668 . PMID 21194474 .
- Zhang, Heng; Liu, Chen-Ying; Zha, Zheng-Yu; Zhao, Bin; Yao, Jun; Zhao, Shimin; Xiong, Yue; Lei, Qun-Ying; Guan, Kun-Liang (2009). "TEAD-transkriptionsfaktorer medierar funktionen av TAZ i celltillväxt och epitelial-mesenkymal övergång" . Journal of Biological Chemistry . 284 (20): 13355–62. doi : 10.1074/jbc.M900843200 . PMC 2679435 . PMID 19324877 .