Protein A
| Protein A, Ig-bindande domän | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Struktur av en domän av protein A som en tre-helix bunt som binder till den tunga variabla kedjan av en VH3 human Fab (vänster). Minimerat protein A bundet till Fc-fragment av Rituximab (höger). Uniprot .
| |||||||||||
| Identifierare | |||||||||||
| Symbol | Spa | ||||||||||
| Pfam | PF02216 | ||||||||||
| InterPro | IPR003132 | ||||||||||
| SCOP2 | 1DEE / SCOPe / SUPFAM | ||||||||||
| |||||||||||
Protein A är ett 42 kDa ytprotein som ursprungligen fanns i cellväggen hos bakterien Staphylococcus aureus . Den kodas av spa- genen och dess reglering styrs av DNA-topologi, cellulär osmolaritet och ett tvåkomponentsystem som kallas ArlS-ArlR. Det har funnit användning i biokemisk forskning på grund av dess förmåga att binda immunglobuliner . Den är sammansatt av fem homologa Ig-bindande domäner som viker sig till en tre-helixbunt. Varje domän kan binda proteiner från många däggdjursarter, framför allt IgGs . Det binder den tunga kedjan inom Fc-regionen av de flesta immunglobuliner och även inom Fab-regionen när det gäller den humana VH3-familjen. Genom dessa interaktioner i serum, där IgG-molekyler binds i fel orientering (i förhållande till normal antikroppsfunktion ), stör bakterierna opsonisering och fagocytos .
Historia
Som en biprodukt av hans arbete med typspecifika stafylokockantigener, rapporterade Verwey 1940 att en proteinfraktion framställd från extrakt av dessa bakterier ospecifikt utfällde kaninantisera mot olika stafylokocktyper. År 1958 bekräftade Jensen Verweys fynd och visade att kaninsera förimmunisering såväl som normala humansera band till den aktiva komponenten i stafylokockextraktet; han betecknade denna komponent Antigen A (eftersom den hittades i fraktion A av extraktet) men trodde att det var en polysackarid. Felklassificeringen av proteinet var resultatet av felaktiga tester men det dröjde inte länge därefter (1962) som Löfkvist och Sjöquist korrigerade felet och bekräftade att Antigen A faktiskt var ett ytprotein på bakterieväggen hos vissa stammar av S. aureus . Bergensgruppen från Norge döpte proteinet till "Protein A" efter antigenfraktionen som isolerats av Jensen.
Protein A antikroppsbindning
Det har visats genom kristallografisk förfining att det primära bindningsstället för protein A är på Fc-regionen, mellan CH 2- och CH 3 -domänerna. Dessutom har protein A visats binda humana IgG-molekyler innehållande IgG F(ab')2-fragment från den humana VH3-genfamiljen.
Protein A kan binda med stark affinitet till Fc-delen av immunglobulin från vissa arter som visas i tabellen nedan.
| Arter | Underklass | Bindande |
|---|---|---|
| Mänsklig | IgA | variabel |
| IgD | svag eller ingen | |
| IgE | svag eller ingen | |
| IgG 1 | stark | |
| IgG 2 | stark | |
| IgG 3 | svag eller ingen | |
| IgG 4 | stark | |
| IgM | variabel | |
| Fågeläggula | IgY | svag eller ingen |
| Bovin | medium | |
| Hund | medium | |
| Get | svag eller ingen | |
| marsvin | IgG 1 | stark |
| Hamster | svag | |
| Häst | medium | |
| Koala | svag eller ingen | |
| Lama | svag eller ingen | |
| Apa (rhesus) | stark | |
| Murine | IgG 1 | svag |
| IgG 2a | stark | |
| IgG 2 | medium till stark | |
| IgG 3 | medium | |
| IgM | variabel | |
| Gris | medium till stark | |
| Kanin | stark | |
| Råtta | IgG 1 | svag eller ingen |
| IgG 2a | svag eller ingen | |
| IgG 2b | svag eller ingen | |
| IgG 3 | svag | |
| Får | svag eller ingen |
Andra antikroppsbindande proteiner
Förutom protein A används andra immunglobulinbindande bakterieproteiner såsom Protein G , Protein A/G och Protein L alla vanligtvis för att rena, immobilisera eller detektera immunglobuliner.
Roll i patogenes
Som patogen använder Staphylococcus aureus protein A, tillsammans med en mängd andra proteiner och ytfaktorer, för att hjälpa dess överlevnad och virulens. För detta ändamål spelar protein A en mångfacetterad roll:
- Genom att binda Fc-delen av antikroppar gör protein A dem otillgängliga för opsoninerna, vilket försämrar fagocytos av bakterierna via immuncellsattack.
- Protein A underlättar vidhäftningen av S. aureus till human von Willebrand-faktor (vWF)-belagda ytor, vilket ökar bakteriernas infektionsförmåga vid platsen för hudpenetration.
- Protein A kan inflammera lungvävnad genom att binda till tumörnekrosfaktor 1 (TNFR-1) receptorer. Denna interaktion har visat sig spela en nyckelroll i patogenesen av stafylokockpneumoni.
- Protein A har visat sig försvaga humoral (antikroppsmedierad) immunitet vilket i sin tur innebär att individer kan infekteras upprepade gånger med S. aureus eftersom de inte kan ge ett starkt antikroppssvar.
- Protein A har visat sig främja bildningen av biofilmer både när proteinet är kovalent kopplat till bakteriens cellvägg såväl som i lösning.
Protein A hjälper till att hämma fagocytisk uppslukning och fungerar som en immunologisk förklädnad. Högre nivåer av protein A i olika stammar av S. aureus har associerats med nasal transport av denna bakterie.
Mutanter av S. aureus som saknar protein A fagocyteras mer effektivt in vitro, och mutanter i infektionsmodeller har minskad virulens.
Produktion
Protein A produceras och renas i industriell fermentering för användning inom immunologi, biologisk forskning och industriella tillämpningar (se nedan). Naturligt (eller nativt) protein A kan odlas i Staphylococcus aureus och innehåller de fem homologa antikroppsbindande regionerna som beskrivs ovan och en C-terminal region för cellväggsfästning. Idag produceras protein A vanligare rekombinant i Escherichia coli . ( Brevibacillus har också visat sig vara en effektiv värd.) Rekombinanta versioner av protein A innehåller också de fem homologa antikroppsbindande domänerna men kan variera i andra delar av strukturen för att underlätta koppling till porösa substrat Konstruerade versioner av proteinet finns också tillgängliga, varav den första var rProtein A, B4, C-CYS. Konstruerade versioner är multimerer (vanligtvis tetramerer, pentamerer eller hexamerer) av en enda domän som har modifierats för att förbättra användbarheten i industriella applikationer.
Forskning
Protein A är ofta kopplat till andra molekyler såsom ett fluorescerande färgämne , enzymer , biotin , kolloidalt guld eller radioaktivt jod utan att påverka antikroppens bindningsställe. Exempel inklusive protein A-guld (PAG)-färgning används i immunogoldmärkning , fluoroforkopplat protein A för immunfluorescens och DNA-dockningssträngkopplat protein A för DNA-PAINT-avbildning. Det används också i stor utsträckning kopplat till magnetiska, latex- och agarospärlor .
Protein A immobiliseras ofta på ett fast underlag och används som en pålitlig metod för att rena totalt IgG från råproteinblandningar såsom serum eller ascitesvätska , eller kopplas till en av ovanstående markörer för att detektera närvaron av antikroppar. Det första exemplet på att protein A kopplas till en porös pärla för rening av IgG publicerades 1972. Immunoutfällningsstudier med protein A konjugerat till pärlor används också vanligtvis för att rena proteiner eller proteinkomplex indirekt genom antikroppar mot proteinet eller proteinkomplexet av intresse .
Roll i industriell rening av antikroppar
Den första hänvisningen i litteraturen till ett kommersiellt tillgängligt protein A-kromatografiharts dök upp 1976. Idag är kromatografisk separation med användning av protein A immobiliserat på porösa substrat den mest etablerade metoden för att rena monoklonala antikroppar (mAbs) från skördad cellkultursupernatant. Valet av protein A som den föredragna metoden beror på den höga renheten och utbytet som lätt och tillförlitligt uppnås. Detta utgör grunden för en generell antikroppsrenings"plattform" som förenklar tillverkningsoperationer och minskar den tid och ansträngning som krävs för att utveckla reningsprocesser. En typisk mAb-reningsprocess visas till höger. Även om protein A-kromatografin har lång historia för produktion av antikroppar, förbättras processen fortfarande idag. Kontinuerlig kromatografi, närmare bestämt periodisk motströmskromatografi, ökar reningsstegets produktivitet enormt.