Överföringens ursprung
Ett ursprung för överföring ( oriT ) är en kort sekvens som sträcker sig från 40-500 baspar i längd som är nödvändig för överföring av DNA från en gramnegativ bakteriedonator till mottagaren under bakteriell konjugering . Överföringen av DNA är en kritisk komponent för antimikrobiell resistens inom bakterieceller och oriT -strukturen och mekanismen inom plasmid-DNA är komplementär till dess funktion vid bakteriell konjugering. Den första oriT som identifierades och klonades var på den RK2 (IncP) konjugativa plasmiden, vilket gjordes av Guiney och Helinski 1979.
Strukturera
oriT- regioner är centrala i processen att överföra DNA från givaren till mottagaren och innehåller flera viktiga regioner som underlättar detta:
- nic -ställe : där det avlindade plasmid-DNA:t skärs; vanligtvis platsspecifik.
- En inverterad upprepad sekvens: signalerar slutet av replikationen av donator-DNA och är ansvarig för överföringsfrekvens, plasmidmobilisering och sekundär DNA-strukturbildning.
- AT-rik region: viktig för DNA-strängsöppning och är belägen intill de inverterade upprepade sekvenserna.
oriT är en icke - kodande region av bakteriens DNA. På grund av sin viktiga roll för att initiera bakteriell konjugering oriT både ett enzymsubstrat och igenkänningsställe för relaxasproteinerna . Relaxosomer har oriT- specifika hjälpfaktorer som hjälper den att identifiera och binda till oriT . Uppströms om oriT nic -stället finns en termineringssekvens.
oriT är i första hand cis - verkande, vilket möjliggör en mer effektiv DNA-överföring.
Mekanism och funktion i bakteriell konjugering
I början av bakteriell konjugering kommer en donatorcell att utveckla en pilus och signalera till en närliggande mottagarcell att komma i nära kontakt. Denna identifiering av en lämplig mottagarcell kommer att påbörja processen för bildande av parningspar. Denna process att föra samman de två cellerna rekryterar utsöndringssystemet av typ IV , ett proteinkomplex som bildar överföringskanalen mellan givaren och mottagaren, och startar bildandet av relaxationskomplexet känt som relaxosomen vid oriT .
En plasmids oriT -sekvens fungerar både som en igenkänningspunkt och ett substrat för enzymerna i relaxosomen, därför sker det första steget av bakteriell konjugation vid nicn- stället i oriT -regionen av plasmiden. Relaxasenzymer , även kända som DNA-strängtransferaser som ingår i relaxosomkomplexet, katalyserar en sträng- och platsspecifik fosfodiesterbindningsklyvning vid nicn -stället och är specifika för varje plasmid. Denna reaktion är en trans-esterifiering , som producerar ett hackat dubbelsträngat DNA med 5'-änden bunden till en tyrosinrest i relaxaset. Relaxaset rör sig sedan mot 3'-änden av strängen för att linda upp DNA:t i plasmiden.
Den andra strängen av plasmiden, strängen som inte hackades av relaxaset, är en mall för vidare syntes av DNA-polymeras .
När relaxaset når uppströmsdelen av oriT igen där det finns en inverterad upprepning , avslutas processen genom att återförena ändarna av plasmiden och frigöra en enkelsträngad plasmid i mottagaren.
Ansökningar
Genteknik
Konjugering möjliggör överföring av målgener till många mottagare, inklusive jäst , däggdjursceller och kiselalger .
Kiselalger kan vara användbara plasmidvärdar eftersom de har potential att autotrofiskt producera biobränslen och andra kemikalier. Det finns några metoder för genetisk överföring för kiselalger, men de är långsamma jämfört med bakteriell konjugering. Genom att designa plasmider för kiselalgerna P. tricornutum och T. pseudonana baserat på sekvenser för jäst och utveckla en metod för konjugering från E. coli till kiselalgerna hoppas forskarna kunna främja genetisk manipulation i kiselalger.
Ett av huvudproblemen med att använda bakteriell konjugering i genteknik är att vissa valbara markörer på plasmiderna genererar bakterier som har resistens mot antibiotika som ampicillin och kanamycin .
Antimikrobiell resistens
Interaktionen mellan DNA eller riT och relaxas möjliggör antimikrobiell resistens via horisontell genöverföring ( Figur 1). Olika oriT- regioner i plasmid-DNA innehåller inverterade upprepningar till vilka relaxasproteiner kan binda. Viktiga bidragsgivare till läkemedelsresistens är mobila genomiska öar (MGIs), eller segment i DNA som finns i liknande bakteriestammar och är faktorer i diversifiering av bakterier. MGI ger resistens mot sina värdceller och sprider denna fördel till andra celler genom bakteriell konjugering. Med bakteriecells-MGI som har sina egna oriT- sekvenser och ligger i närheten av relaxosomgener , är de mycket lika konjugativa plasmider som är ansvariga för förekomsten av läkemedelsresistens bland bakterieceller. En studie från 2017 på MGI: er avslöjade att de själva kan integrera sig i genomet hos de mottagande bakteriecellerna via int , en gen som kodar för integrasenzymet . Efter att oriT av MGI har bearbetats av relaxosomer som kodas av integrativa och konjugativa element (ICE), kan MGI komma in i mottagarcellernas genom och möjliggöra multiformiteten av bakterier som leder till antimikrobiell resistens.