Överför DNA
Överförings -DNA (förkortat T-DNA ) är det överförda DNA:t från den tumörinducerande (Ti) plasmiden från vissa arter av bakterier såsom Agrobacterium tumefaciens och Agrobacterium rhizogenes (egentligen en Ri-plasmid) . T-DNA:t överförs från bakterien till värdväxtens nukleära DNA- genom . Förmågan hos denna specialiserade tumörinducerande (Ti) plasmid tillskrivs två väsentliga regioner som krävs för DNA-överföring till värdcellen. T-DNA:t kantas av 25-baspar upprepningar i varje ände. Överföring initieras vid den högra gränsen och avslutas vid den vänstra gränsen och kräver vir- gener från Ti-plasmiden.
Det bakteriella T-DNA:t är cirka 24 000 baspar långt och innehåller växtuttryckta gener som kodar för enzymer som syntetiserar opiner och fytohormoner . Genom att överföra T-DNA till växtgenomet omprogrammerar bakterien i huvudsak växtcellerna så att de växer till en tumör och producerar en unik matkälla för bakterierna. Syntesen av växthormonerna auxin och cytokinin av enzymer som kodas i T-DNA:t gör det möjligt för växtcellen att växa över och på så sätt bilda krongalltumörer som typiskt induceras av Agrobacterium tumefaciens- infektion. Agrobacterium rhizogenes orsakar en liknande infektion som kallas hårrotssjukdom . Opinerna är aminosyraderivat som används av bakterien som en källa till kol och energi . Denna naturliga process av horisontell genöverföring i växter används som ett verktyg för grundläggande och tillämpad forskning inom växtbiologi genom Agrobacterium tumefaciens- medierad främmande gentransformation och insättningsmutagenes. Växtgenom kan konstrueras genom användning av Agrobacterium för leverans av sekvenser som är värd för binära T-DNA-vektorer .
Mekanism för omvandling i naturen
Infektionen av T-DNA i värdcellen och integrationen i dess kärna involverar flera steg. Först förökar sig bakterierna i sårsaften före infektion och fäster sig sedan på växtens cellväggar. De bakteriella virulensgenernas uttryck av cirka 10 operoner aktiveras av perception av fenoliska föreningar såsom acetosyringon som emitteras av skadad växtvävnad och följer cell-cell-kontakt. Därefter fortsätter denna process med den makromolekylära translokationen från Agrobacterium till värdcellens cytoplasma, överföring av T-DNA tillsammans med associerade proteiner (kallat T-komplex ) till värdcellskärnan följt av demontering av T-komplexet, stabil integration av T- DNA in i värdväxtens genom och eventuellt uttryck av de överförda generna . Integreringen av T-DNA i ett värdgenom involverar bildandet av ett enkelsträngat hack i DNA:t vid den högra gränsen av Ti-plasmiden. Detta hack skapar en region av enkelsträngat DNA från den vänstra gränsen av T-DNA-genen över till den högra gränsen som skars. Sedan fäster enkelsträngade bindande proteiner till det enkelsträngade DNA:t. DNA-syntes förskjuter den enkelsträngade regionen och sedan frisätter ett andra hack vid den vänstra gränsregionen det enkelsträngade T-DNA-fragmentet. Vidare kan detta fragment inkorporeras i ett värdgenom.
Agrobacterium har varit känt för att utveckla ett kontrollsystem som använder växtvärdfaktorer och cellulära processer för flera vägar för värdväxtförsvarssvar för att invadera värdcellskärnan. För integrering av T-DNA i målvärdgenomet Agrobacterium flera interaktioner med värdväxtfaktorer. För att interagera med värdväxtproteiner många Agrobacterium virulensproteiner kodade av vir-gener. Agrobacterium vir- genuttryck sker via VirA-VirG-sensorn som resulterar i generering av en mobil enkelsträngad T-DNA-kopia (T-sträng). En bearbetad form av VirB2 är huvudkomponenten i T-komplexet som krävs för transformation. VirD2 är proteinet som täcker 5′-änden av den överförda T-strängen genom kovalent bindning och transporteras till värdcellens cytoplasma. VirE2 är det enkelsträngade DNA-bindande proteinet som förmodligen täcker T-strängen i värdcytoplasman genom kooperativ bindning. Det riktas sedan in i kärnan via interaktioner med värdcellsproteiner såsom importin a, bakteriellt VirE3 och dyneinliknande proteiner. Flera andra bakteriella virulenseffektorer som VirB5, VirB7 (de mindre komponenterna i T-komplexet), VirD5, VirE2, VirE3 och VirF som också kan interagera med proteiner från värdväxtceller.
Används inom bioteknik
Agrobacterium -medierad T-DNA-överföring används i stor utsträckning som ett verktyg inom bioteknik . I mer än två decennier Agrobacterium tumefaciens utnyttjats för att introducera gener i växter för grundforskning såväl som för kommersiell produktion av transgena grödor . Inom genteknik avlägsnas de tumörfrämjande och opinsyntesgenerna från T-DNA:t och ersätts med en gen av intresse och/eller en selektionsmarkör, som krävs för att fastställa vilka växter som framgångsrikt har transformerats. Exempel på selektionsmarkörer inkluderar neomycin-fosfotransferas, hygromycin B-fosfotransferas (som båda fosforylerar antibiotika) och fosfinotricin-acetyltransferas (som acetylerar och deaktiverar fosfinotricin , en potent hämmare av glutaminsyntetas ) eller formuleringar som herbicider , såsom herbicider. Ett annat selektionssystem som kan användas är användning av metaboliska markörer såsom fosfo-mannosisomeras. Agrobacterium används sedan som en vektor för att överföra det konstruerade T-DNA:t till växtcellerna där det integreras i växtgenomet. Denna metod kan användas för att generera transgena växter som bär en främmande gen. Agrobacterium tumefaciens kan effektivt överföra främmande DNA till både enhjärtbladiga och tvåhjärtbladiga växter samtidigt som de tar hand om kritiskt viktiga faktorer som genotypen av växter, typer och åldrar på vävnader som inokulerats, typ av vektorer, stammar av Agrobacterium , gener för selektionsmarkörer och selektiva medel, och olika tillstånd för vävnadsodling.
Samma procedur för T-DNA-överföring kan användas för att störa gener via insättningsmutagenes . Inte bara skapar den infogade T-DNA-sekvensen en mutation utan dess insättning "taggar" också den påverkade genen, vilket möjliggör dess isolering som T-DNA-flankerande sekvenser. En reportergen kan kopplas till den högra änden av T-DNA:t som ska transformeras tillsammans med en plasmidreplikon och en selekterbar antibiotika (såsom hygromycin )-resistensgen och kan explicitera cirka 30 % av genomsnittlig effektivitet med framgångsrika T-DNA-insättningar inducerade genfusioner i Arabidopsis thaliana .
Omvänd genetik innebär att testa den förmodade funktionen hos en gen som är känd genom att störa den och sedan leta efter effekten av den inducerade mutationen på den organismala fenotypen. T-DNA-märkningsmutagenes involverar screening av populationer genom T-DNA-insättningsmutationer. Samlingar av kända T-DNA-mutationer ger resurser för att studera funktionerna hos individuella gener, som utvecklats för modellväxten Arabidopsis thaliana . Exempel på T-DNA-insättningsmutationer i Arabidopsis thaliana inkluderar de som är associerade med många klasser av fenotyper inklusive dödliga plantor, storleksvarianter, pigmentvarianter, embryodefekter, reducerad fertilitet och morfologiskt eller fysiologiskt avvikande växter.
Se även
Vidare läsning
- Raven PH, Evert RF, Eichhorn SE (2005). Biology of Plants (7:e upplagan). New York: WH Freeman and Company Publishers. ISBN 0-7167-1007-2 .