Yxa ribozym

Hatchet
Consensus sekundär struktur och sekvenskonservering av Hatchet ribozym
Identifiers
Symbol	Yxa
Rfam	RF02678
Övriga uppgifter
RNA -typ	Gen ; Ribozyme
GÅ	GO: 0003824
SÅ	SO:0000374
PDB- strukturer	PDBe

Bakgrund: Yxribozymet är en RNA-struktur som katalyserar sin egen klyvning på ett specifikt ställe . Det är med andra ord ett självklyvande ribozym . Hatchet ribozymes upptäcktes av en bioinformatikstrategi som RNA associerade med gener associerade med Twister och Hammerhead ribozymes, eller RAGATH .

Efterföljande biokemisk analys stöder slutsatsen av en ribozymfunktion och fastställer ytterligare egenskaper hos den kemiska reaktion som katalyseras av ribozymet.

Nukleolytiska ribozymer är små RNA:n som antar kompakta veck med förmåga till platsspecifika klyvnings-/ligeringsreaktioner. 14 unika nukleolytiska ribozymer har identifierats hittills, inklusive nyligen upptäckta twister- , pistol- , twister-sister- och yxribozymer som identifierades baserat på tillämpning av jämförande sekvens- och strukturella algoritmer.

Konsensussekvensen och sekundärstrukturen för denna klass inkluderar 13 mycket konserverade och många andra blygsamt konserverade nukleotider som är spridda bland utbuktningar som länkar fyra basparade substrukturer. Ett representativt ribozym med yxa kräver tvåvärda katjoner såsom Mg ²⁺ för att främja RNA-strängklyvning med en maximal hastighetskonstant på ~4/min. Som med alla andra små självklyvande ribozymer som hittills upptäckts, ribozymer en allmän mekanism för katalys som består av en nukleofil attack av en ribos 2'- syreatom på det intilliggande fosforcentrumet. Kinetiska egenskaper hos reaktionen visar att medlemmar av denna ribozymklass har ett väsentligt krav på tvåvärda metallkatjoner och att de har ett komplext aktivt ställe som använder flera katalytiska strategier för att accelerera RNA-klyvning genom intern fosfoesteröverföring.

Mekanism

Nukleolytiska ribozymer som Hatchet Ribozyme antar en SN2-liknande mekanism som resulterar i platsspecifik fosfodiesterbindningsklyvning. En aktiverad 2 ′ -OH av ribosen 5 ′ till det klyvliga fosfatet antar en in-line justering för att rikta in sig på den intilliggande P-O5 ′ fosfodiesterbindningen som ska klyvas, vilket resulterar i bildning av 2 ′ , 3 ′ -cykliskt fosfat 5' - OH-grupper. Röntgenkristallografiska strukturella studier av hammarhuvud , hårnål , GlmS , hepatit deltavirus (HDV), Varkud satellit och pistolribozymer har definierat det övergripande RNA-vecket, det katalytiska fickarrangemanget, in-line-inriktningen och nyckelresterna som bidra till klyvningsreaktionen. Klyvningsstället är beläget vid 5'-änden av dess sekundära konsensusmotiv.

Dessutom gör avlägsnandet av den nukleofila hydroxylen ribozymet inaktivt eftersom det inte kan skapa klyvningsstället. Mer specifikt, om 2'-ribosen eller 2'-OH ersätts med en 2'-deoxiribos eller 2'-H, finns det inga elektroner tillgängliga för att utföra den nukleofila attacken på den intilliggande fosfatgruppen. Detta resulterar i att ingen fosfoesterbindning bildas, vilket återigen inaktiverar ribozymets enzymatiska klyvningsförmåga.

Sekundär struktur

Under 2019 kristalliserade forskare en 2,1 Å-produkt av Hatchet Ribozyme. Konsensussekvensen avbildas i bilden till höger. De flesta ribozymer och ribozymer har i allmänhet en P0-konfiguration. P0 är en extra hårnålsögla placerad vid 5'-änden av klyvningsstället, även om den inte bidrar till katalytisk aktivitet eller funktionalitet till skillnad från Hammerhead -ribozymer som har en kort konsensussekvens nära P1, eller 5'-änden, som främjar höghastighetskatalytisk aktivitet. Cirka 90 % av sekvensen är konserverad och liknar andra ribozymer i denna klass.

Baserat på RNA-sekvensen är den resulterande DNA-sekvensen som slutar koda för Hatchet Ribozyme enligt följande från 5'-3' eftersom uracil i DNA ersätts med tymin.

TTAGCAAGAATGACTATAGTCACTG TTTGTACACCCCGAATAGATTAGAA GCCTAATCATAATCACGTCTGCAAT TTTGGTACA

På grund av denna sekvenskonstruktion, efter självkatalyserad klyvning, lämnar den en rest på 8 nukleotider uppströms på 3'-änden av RNA:t.

Tertiär struktur

Varje ribozym kan ha olika motiv och därmed olika tertiära strukturer:

Den tertiära strukturen hos Hatchet Ribozyme med motivet HT-UUCG är genom dimerisering. Dimeren bildas genom byte av 3'-ändarna av parningssträngarna som också är i jämvikt med den dimerformade produkten av HT-GAAA. Därför skiftar RNA-sekvensen mellan monomer- och dimerkonfigurationer. För att se ribozymets 3D-form, se figur S1A och B. Två molekyler av HT-GAAA-ribozym kan faktiskt bilda en pseudosymmetrisk dimer med båda monomererna av ribozymet som uppvisar relativt väldefinierad elektrontäthet. Det tertiära vecket består av fyra stamunderstrukturer som kovalent staplas på varandra och bildar spiral- och slingstrukturerna, kallade P1, P2, P3 respektive P4, L1, L2 och L3 (men inte visat i figuren ovan). Det faktiska klyvningsstället är placerat mellan förbindelsen mellan Pl och P2 intill P3 och L2. P1 består av tre eller sex baspar ungefär 40 % respektive 60 % av tiden i sitt naturliga tillstånd, vilket tyder på att längden motsvarar katalytisk funktion.

Det finns också en konserverad palindromisk sekvensering mellan bas U70' och A67', vilket sannolikt utlöser bildningen av dimeren på grund av Watson-Crick- basparinteraktioner.

Den tertiära strukturen har också långdistansimplikationer inom sig baserad på interaktioner mellan dess loopar.

Effekt av pH och Mg ²⁺

Ribozymkatalysexperiment utfördes genom tillsats av MgCl2 _och stoppades för mätning vid varje tidpunkt genom tillsats av en stopplösning innehållande urea och EDTA.

En kurva över k obs-värdena uppmätta vid pH 7,5 med ökande koncentrationer av Mg ²⁺ . Det finns en kraftig ökning av ribozymfunktionen som platåer när koncentrationen närmar sig 10 mM. Den branta sluttningen som observerades vid lägre Mg2 ⁺ -koncentrationer tyder på att mer än en metalljon är nödvändig för varje RNA för att uppnå maximal ribozymaktivitet. Dessutom tyder detta på att konstruktionen kräver högre än normala fysiologiska koncentrationer av Mg ²⁺ för att bli fullständigt mättad med Mg ²⁺ som kofaktor. Det är möjligt att nativa unimolekylära konstruktioner, som också bär P0, kan uppnå mättnad vid koncentrationer av Mg ²⁺ som är närmare normala fysiologiska nivåer.

Effekten av pH på ribozymhastighetskonstanten i reaktioner innehållande 10 mM Mg2 ⁺ mättes också experimentellt. pH-beroende ribozymaktivitet ökar linjärt med en lutning på 1 tills man når en k obs, av en Michaelis-Menten-plot , platå på ~4/min nära ett pH-värde på 7,5. Alla högre pH har samma katalytiska effekt och surare pH börjar denaturera ribozymet och därmed minska den katalytiska funktionen. Både pH-beroendet och den maximala hastighetskonstanten har intressanta konsekvenser för de möjliga katalytiska strategierna som används av denna ribozymklass.

Effekterna av olika en- och tvåvärda metalljoner på ribozymaktivitet

Hatchet- ribozymkonstruktionen förblir helt inaktiv när den inkuberas i frånvaro av Mg ²⁺ i reaktioner som endast innehåller andra envärda katjoner vid 1 M (Na ⁺ , K ⁺ , Rb ⁺ , Li ⁺ , Cs ⁺ ), 2,5 M (Na ⁺ , K ⁺ ) eller 3 M (Li ⁺ ). Däremot stödjer andra tvåvärda metalljoner såsom Mn2 ⁺ , Co2 ⁺ , Zn2 ⁺ och Cd2 ⁺ ribozymfunktion med varierande effektivitetsnivåer. Vidare fungerar två metalljoner (Zn ²⁺ , Cd ²⁺ ) endast vid låga koncentrationer, och tre metalljoner (Ba ²⁺ , Ni ²⁺ och Cu ²⁺ ) hämmar aktiviteten vid 0,5 mM, även när Mg ²⁺ är närvarande. Dessa resultat indikerar att ribozymer med yxa är relativt restriktiva i sin användning av katjoner för att främja katalys, vilket kanske indikerar att ett eller flera specialiserade bindningsställen som rymmer ett begränsat antal tvåvärda katjoner finns närvarande i RNA-strukturen eller kanske till och med på det aktiva stället. Hämning av vissa tvåvärda metalljoner kan bero på undanträngning av kritiska Mg ²⁺ -joner eller av allmän störning av RNA-veckning.

Betydelse/tillämpningar

En standardapplikation är att använda flankerande självklyvande ribozymer för att generera exakt utskurna sekvenser av funktionella RNA-molekyler (dvs shRNA , saiRNA , sgRNA ). Detta är särskilt användbart för in vivo-expression av genredigeringssystem (dvs. CRISPR / Cas sgRNA ) och hämmande system.

En annan metod är för in vivo-transkription av siRNA . Denna design använder flera självklyvande ribozymer, som alla transkriberas från samma gen. Efter klyvning kan båda delarna av prekursorn siRNA (siRNA 1 och 2) bilda en dubbelsträng och agera som avsett. För att se inställningen, se saiRNA-grafiken

Slutligen, om du vill kombinera självklyvande ribozymer med proteinsekvenser, är det viktigt att veta att den självklyvande mekanismen för ribozymer kommer att modifiera mRNA. Ett 5'-ribozym kommer att modifiera nedströms 5'-änden av pre-mRNA:t, vilket gör att cellen inte kan skapa en 5'-kapsel. Detta minskar stabiliteten hos pre-mRNA:t och förhindrar att det är fullt funktionellt mogen mRNA. Å andra sidan skulle ett 3'-ribozym förhindra polyadenylering av uppströms pre-mRNA, vilket återigen minskar stabiliteten och förhindrar mognad. Båda stör också översättningen.