CRISPR-störningar
CRISPR-interferens ( CRISPRi ) är en genetisk störningsteknik som möjliggör sekvensspecifik repression av genuttryck i prokaryota och eukaryota celler. Den utvecklades först av Stanley Qi och kollegor i laboratorierna av Wendell Lim , Adam Arkin, Jonathan Weissman och Jennifer Doudna . Sekvensspecifik aktivering av genuttryck hänvisar till CRISPR-aktivering (CRISPRa) .
Baserat på det bakteriella genetiska immunsystemet - CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) pathway, ger tekniken ett komplementärt tillvägagångssätt för RNA-interferens . Skillnaden mellan CRISPRI och RNAi är dock att CRISPRi reglerar genuttryck främst på transkriptionsnivå, medan RNAi styr gener på mRNA-nivå.
Bakgrund
Många bakterier och de flesta archaea har ett adaptivt immunsystem som innehåller CRISPR RNA (crRNA) och CRISPR-associerade (cas) gener.
CRISPR-interferenstekniken (CRISPRi) rapporterades först av Lei S. Qi och forskare vid University of California i San Francisco i början av 2013. Tekniken använder ett katalytiskt dött Cas9 (vanligtvis betecknat dCas9)-protein som saknar endonukleasaktivitet för att reglera gener på ett RNA-styrt sätt. Inriktningsspecificitet bestäms genom komplementär basparning av ett enda guide-RNA (sgRNA) till det genomiska stället. sgRNA är ett chimärt icke-kodande RNA som kan delas in i tre regioner: en 20 nt basparningssekvens, en 42 nt dCas9-bindande hårnål och en 40 nt terminator (bakterier, jäst, fruktflugor, zebrafiskar, möss).
Vid design av ett syntetiskt sgRNA modifieras endast 20 nts basparningssekvens. Sekundära variabler måste också beaktas: effekter utanför målet (för vilka en enkel BLAST-körning av basparningssekvensen krävs), underhåll av den dCas9-bindande hårnålsstrukturen och säkerställande av att inga restriktionsställen finns i det modifierade sgRNA:t, eftersom detta kan utgöra ett problem i nedströms kloningssteg. På grund av sgRNA-designens enkelhet är denna teknologi mottaglig för genom-omfattande skalning. CRISPRi är beroende av genereringen av katalytiskt inaktiva Cas9. Detta åstadkoms genom att introducera punktmutationer i de två katalytiska resterna (D10A och H840A) av genen som kodar för Cas9. Genom att göra det kan dCas9 inte klyva dsDNA men behåller förmågan att rikta DNA. Tillsammans utgör sgRNA och dCas9 ett minimalt system för genspecifik reglering.
Transkriptionsreglering
Undertryckande
CRISPRi kan steriskt undertrycka transkription genom att blockera antingen transkriptionsinitiering eller förlängning. Detta åstadkoms genom att utforma sgRNA som är komplementärt till promotorn eller de exoniska sekvenserna. Nivån av transkriptionell repression med ett mål inom den kodande sekvensen är strängspecifik. Beroende på typen av CRISPR-effektor leder antingen mallen eller icke-mallsträngen till starkare förtryck. För dCas9 (baserat på ett typ-2 CRISPR-system) är förtrycket starkare när guide-RNA:t är komplementärt till icke-mallsträngen. Det har föreslagits att detta beror på aktiviteten hos helikas, som lindar upp RNA:DNA-heteroduplexet före RNA pol II när sgRNA:t är komplementärt till mallsträngen. Till skillnad från transkriptionsförlängningsblocket är tystnad oberoende av den riktade DNA-strängen när man riktar in sig på transkriptionsstartstället. Hos prokaryoter kan denna steriska hämning undertrycka transkriptionen av målgenen med nästan 99,9 %; i archaea uppnåddes mer än 90 % förtryck; i mänskliga celler observerades upp till 90 % repression. I bakterier är det möjligt att mätta målet med en tillräckligt hög nivå av dCas9-komplex. I detta fall beror repressionsstyrkan endast på sannolikheten att dCas9 stöts ut vid kollision med RNA-polymeraset, vilket bestäms av guidesekvensen. Högre temperaturer är också förknippade med högre utstötningssannolikhet, alltså svagare repression. I eukaryoter kan CRISPRi även undertrycka transkription via en effektordomän. Genom att fusionera en repressordomän till dCas9 kan transkription undertryckas ytterligare genom att inducera heterokromatinisering. Till exempel kan den välstuderade Krüppel-associerade box -domänen (KRAB) fusioneras till dCas9 för att undertrycka transkription av målgenen upp till 99% i mänskliga celler.
Förbättringar av effektiviteten
Medan genomredigering av det katalytiskt aktiva nukleaset Cas9 kan åtföljas av irreversibla genomiska förändringar utanför målet, är CRISPRi mycket specifik med minimala reversibla effekter utanför målet för två distinkta sgRNA-sekvenser. Icke desto mindre har flera metoder utvecklats för att förbättra effektiviteten av transkriptionsmodulering. Identifiering av transkriptionsstartstället för en målgen och övervägande av preferenser för sgRNA förbättrar effektiviteten, liksom närvaron av tillgängligt kromatin vid målstället.
Andra metoder
Tillsammans med andra förbättringar som nämnts kan faktorer såsom avståndet från transkriptionsstarten och det lokala kromatintillståndet vara kritiska parametrar för att bestämma aktiverings-/repressionseffektiviteten. Optimering av dCas9 och sgRNA-uttryck, stabilitet, nukleär lokalisering och interaktion kommer sannolikt att möjliggöra ytterligare förbättring av CRISPRi-effektiviteten i däggdjursceller.
Ansökningar
Gen knockdown
En betydande del av genomet (både reportergener och endogena gener) i eukaryoter har visat sig vara målinriktade med hjälp av lentivirala konstruktioner för att uttrycka dCas9 och sgRNA, med jämförbar effektivitet med befintliga tekniker som RNAi och TALE-proteiner. I tandem eller som sitt eget system kan CRISPRi användas för att uppnå samma applikationer som i RNAi.
För bakterier har gennedbrytning av CRISPRi implementerats och karakteriserats fullt ut (analys utanför målet, läckande repression) för både Gram-negativ E. coli och Gram-positiv B. subtilis .
Inte bara i bakterier utan även i archaea (t.ex. M. acetivorans ) CRISPRi-Cas9 användes framgångsrikt för att slå ner flera gener/operoner som relaterade till kvävefixering.
Allelic-serien
Differentiellt genuttryck kan uppnås genom att modifiera effektiviteten av sgRNA-basparning till målloci. I teorin kan modulering av denna effektivitet användas för att skapa en allelserie för en given gen, i huvudsak skapa en samling hypo- och hypermorfer. Dessa kraftfulla samlingar kan användas för att undersöka alla genetiska undersökningar. För hypomorfer tillåter detta en inkrementell minskning av genfunktion i motsats till den binära naturen hos gen-knockouts och oförutsägbarheten av knockdowns. För hypermorfer står detta i motsats till den konventionella metoden att klona genen av intresse under promotorer med varierande styrka.
Genom loci avbildning
Att fusionera ett fluorescerande protein till dCas9 möjliggör avbildning av genomiska loci i levande mänskliga celler. Jämfört med fluorescens in situ hybridisering (FISH) tillåter metoden unikt dynamisk spårning av kromosomloki. Detta har använts för att studera kromatinarkitektur och nukleär organisationsdynamik i laboratoriecellinjer inklusive HeLa-celler.
Stamceller
Aktivering av Yamanaka-faktorer av CRISPRa har använts för att inducera pluripotens i mänskliga och musceller, vilket ger en alternativ metod till iPS-teknik. Dessutom kan storskaliga aktiveringsskärmar användas för att identifiera proteiner som främjar inducerad pluripotens eller, omvänt, främjar differentiering till en specifik cellinje.
Genetisk screening
Möjligheten att uppreglera genuttryck med dCas9-SunTag med en enda sgRNA öppnar också dörren till storskaliga genetiska skärmar, såsom Perturb-seq , för att avslöja fenotyper som är ett resultat av ökat eller minskat genuttryck, vilket kommer att vara särskilt viktigt för att förstå effekterna av genreglering vid cancer. Dessutom har CRISPRi-system visat sig vara överförbara via horisontella genöverföringsmekanismer såsom bakteriell konjugation och specifik repression av reportergener i mottagarceller har visats. CRISPRi skulle kunna fungera som ett verktyg för genetisk screening och potentiell bakteriell populationskontroll.
Fördelar och begränsningar
Fördelar
- CRISPRi kan tysta en målgen av intresse upp till 99,9 % repression. Styrkan av repressionen kan också ställas in genom att ändra graden av komplementaritet mellan guide-RNA:t och målet. I motsats till inducerbara promotorer tillför partiell repression av CRISPRi inte transkriptionsbrus till målets uttryck. Eftersom repressionsnivån är kodad i en DNA-sekvens kan olika expressionsnivåer odlas i konkurrens och identifieras genom sekvensering.
- Eftersom CRISPRi är baserat på Watson-Crick basparning av sgRNA-DNA och ett NGG PAM-motiv, är urvalet av målbara platser inom genomet enkelt och flexibelt. Noggrant definierade protokoll har utvecklats.
- Flera sgRNA kan inte bara användas för att kontrollera flera olika gener samtidigt (multiplex CRISPRi), utan också för att förbättra effektiviteten av att reglera samma genmål. En populär strategi för att uttrycka många sgRNA samtidigt är att arrangera sgRNA i en enda konstruktion med flera promotorer eller bearbetningselement. Till exempel använder Extra-Long sgRNA Arrays (ELSA) icke-repetitiva delar för att möjliggöra direkt syntes av 12-sgRNA-arrayer från en leverantör av gensyntes, kan integreras direkt i E. coli-genomet utan att homolog rekombination inträffar och kan samtidigt rikta in sig på många gener för att uppnå komplexa fenotyper.
- Även om de två systemen kan vara komplementära, ger CRISPRi fördelar jämfört med RNAi. Som ett exogent system konkurrerar inte CRISPRi med endogena maskiner såsom mikroRNA-uttryck eller funktion. Dessutom, eftersom CRISPRi verkar på DNA-nivå, kan man rikta transkript som icke-kodande RNA, mikroRNA, antisense transkript, nukleärt lokaliserade RNA och polymeras III transkript. Slutligen har CRISPRi ett mycket större målbart sekvensutrymme; promotorer och, i teorin, introner kan också riktas mot.
- I E. coli är konstruktionen av en gen knockdown-stam extremt snabb och kräver endast ettstegs oligo- rekombinering .
Begränsningar
- Kravet på en protospacer adjacent motiv (PAM)-sekvens begränsar antalet potentiella målsekvenser. Cas9 och dess homologer kan använda olika PAM-sekvenser och skulle därför teoretiskt kunna användas för att utöka antalet potentiella målsekvenser.
- Sekvensspecificitet för målloci är endast 14 nt lång (12 nt sgRNA och 2 nt av PAM), vilket kan återkomma omkring 11 gånger i ett mänskligt genom. Repression är omvänt korrelerad med avståndet mellan målstället från transkriptionsstartstället. Genomomfattande beräkningsförutsägelser eller urval av Cas9-homologer med en längre PAM kan minska ospecifik inriktning.
- Endogena kromatintillstånd och modifieringar kan förhindra den sekvensspecifika bindningen av dCas9-sgRNA-komplexet. Nivån av transkriptionell repression i däggdjursceller varierar mellan gener. Mycket arbete krävs för att förstå rollen av lokal DNA-konformation och kromatin i relation till bindnings- och regleringseffektivitet.
- CRISPRi kan påverka gener som är i nära anslutning till målgenen. Detta är särskilt viktigt när man riktar in sig på gener som antingen överlappar andra gener (sens eller antisense överlappande) eller som drivs av en dubbelriktad promotor.
- Sekvensspecifik toxicitet har rapporterats i eukaryoter, med vissa sekvenser i den PAM-proximala regionen som orsakar en stor konditionsbörda. Detta fenomen, som kallas "bad seed effect", är fortfarande oförklarat men kan reduceras genom att optimera uttrycksnivån för dCas9.